李 辰，田 梅，齐雪松，王春燕，曲功霖，邵 帅，王成芳，苟 巧

(中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，辐射防护与核应急中国疾病预防控制中心重点实验室，北京 100088)

流行病学研究显示，接受放射治疗的病人心血管疾病的发病风险显著增加。血管内皮细胞是介导辐射诱导的心血管疾病的关键细胞。血管内皮细胞的损伤和细胞因子分泌是辐射损伤的主要急性效应，这些现象改变了受照机体的内部环境，使其出现慢性炎症状态，从而导致动脉粥样硬化、纤维化等慢性疾病，严重影响接受放射治疗的病人的预后及生活质量。因此，了解X 射线诱导血管内皮细胞损伤的分子机制，对于降低放射治疗的副作用，提高治疗和预后效果，改善接受放射治疗病人的生活质量具有重要意义。

细胞焦亡(pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡过程，由细菌、病毒、毒性物质或者损伤刺激引起的程序化细胞死亡过程。相比其他形式的细胞死亡，细胞焦亡具有其特有的细胞死亡形态和机制。然而，这种形式的死亡从细胞形态上类似于坏死，细胞在接受外源性危险信号后，主要表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放，进而激活强烈的炎症反应，最后导致细胞死亡。这一过程的关键分子是Caspase-1，它能够被炎症小体激活，激活的Caspase-1又会激活下游的分子，导致炎症因子的释放和打孔蛋白的作用，最终导致细胞破裂。细胞发生焦亡时，由于细胞膜的裂解，导致大量危险相关模式分子如ATP、DNA 以及IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18 等细胞因子释放到细胞外基质中，这又会导致众多免疫细胞的聚集，从而延长组织内的炎症级联反应。在前期研究中，本课题组发现，不同于细胞凋亡的典型表现(如细胞皱缩、凋亡小体的形成)， 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)在受照后出现类似“细胞焦亡”的细胞胀大现象。此外，许多研究表明受电离辐射作用的细胞或组织通常会释放出大量炎症因子。由此推测，X射线照射的HUVEC在受照后可能发生细胞焦亡过程。本研究探讨单次大剂量X 射线照射对HUVEC焦亡和炎性因子分泌的影响，并分析单次大剂量和多次小剂量X 射线照射对细胞焦亡影响的差异性。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

胎牛血清、RPMI 1640 培养液均购自美国GIBCO公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18 ELISA试剂盒购自博士德生物公司，cleaved Caspase-1抗体，β-tublin抗体购自美国Cell Signaling 公司，Western blot 蛋白裂解液购自美国Pierce 公司、发光检测试剂盒购自美国Millipore 公司，蛋白定量试剂盒、硝酸纤维素膜均购自北京普利莱公司，牛血清白蛋白购自美国Amresco 公司，戊二醛购自美国SPI Supplies 公司，OsO-PBS 购自美国Ted Pella 公司，乙醇、丙酮均购自美国Sigma-Aldrich 公司，发光检测成像系统ChemiDoc XRC+为美国Bio-Rad 公司产品，FACS Calibur 型流式细胞仪购自美国BD 公司，透射电子显微镜为日本电子公司产品，医用直线加速器Precise购自瑞典Eleckta公司。

1.2 细胞培养

实验采用的HUVEC 由本实验室保存。细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养液培养，置于37 ℃、CO体积分数为5%、饱和湿度条件下的培养箱中。

1.3 细胞照射条件

细胞实验采用火箭军总医院医用直线加速器Precise 进行X 线照射。剂量率为5 Gy/min，源靶距100 cm。单次大剂量照射10 Gy 后ELISA 检测细胞分泌的4种炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-18)的情况，Western blot 检测Caspase-1 蛋白活化水平及透射电镜观察细胞焦亡形态；采用流式细胞术检测单次大剂量照射10 Gy 和多次小剂量照射(2.5 Gy/d，连续照射4 d)细胞焦亡率的差异。

1.4 ELISA法检测细胞因子

细胞焦亡是一种炎症性细胞程序性死亡过程，因此为证明X 射线诱导细胞焦亡的发生，采用ELISA 方法检测了X 射线照射后0、6、12、24、48 和72 h HUVEC 分泌4 种炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-18)的情况。按ELISA 试剂盒说明书进行操作。将标准品和待测样品各100 μL 依次加入孔中。酶标板加上封板膜，37 ℃反应90 min。反应后洗去酶标板内的液体。将准备好的生物素抗人相应抗体工作液按每孔100 μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜，37 ℃反应60 min。1×洗涤缓冲液洗涤3 次，每次浸泡1 min 左右。将准备好的ABC 工作液按每孔100 μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜，37 ℃反应30 min。1×洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2 min。按每孔90 μL依次加入已在37 ℃平衡30 min的TMB显色液，37 ℃避光反应15～20 min。按每孔100 μL依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度

D

(450)值。再根据标准品曲线计算细胞因子浓度。

1.5 Western blot法检测蛋白表达

细胞焦亡的关键执行蛋白为Caspase-1，而其被剪切成活化状态是细胞焦亡的关键步骤，因此本研究采用Western blot 技术检测了受照细胞中活化的Caspase-1 的表达。提取细胞全蛋白并定量，与5×蛋白上样缓冲液混匀，置于沸水中加热5 min 后，迅速放入冰中冷却。取各组等量蛋白行SDS-PAGE 电泳，并采用硝酸纤维素膜转膜，5% BSA 封闭后分别用活化的Caspase-1和β-tublin 一抗孵育，4 ℃过夜，二抗孵育，室温1 h，滴加发光液，用发光检测成像系统拍摄条带图像检测蛋白表达，Western blot图片灰度分析采用ImageJ图像处理软件进行分析。

1.6 透射电子显微镜观察细胞形态

采用0.25% Trypsin 消化细胞5 min，终止消化后1 000 r/min 离心3 min，去上清，在加入1 mL 2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中固定3 h。之后由北京大学医学部电镜平台制作样品，具体步骤为：用磷酸盐缓冲液洗涤3 次，在1% OsO-PBS(pH=7.0)中固定1 h 后，在PBS 中洗涤3 次。然后，将样品用梯度系列(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)乙醇脱水，每步脱水10 min，然后转移到丙酮中15 min。样品在体积比为1∶1 的丙酮和EPON 树脂混合物中于室温放置1 h，再转入体积比为1∶3 丙酮和EPON 树脂混合物中过夜。将标本置于包埋介质中，在37 ℃加热约24 h，60 ℃加热约48 h，最后用乙酸铀酰和碱性柠檬酸铅染色15 min，在透射电子显微镜中观察细胞肿胀等细胞焦亡的形态变化并拍照。

1.7 流式细胞术检测细胞焦亡率

FLICA 染料为可通过细胞的、无毒的、荧光标记caspase 的抑制剂，可以与细胞内活性的caspase 结合。羧基荧光素标记肽(Tyr-Val-Ala-Asp)-fluoromethyl ketone(FAM-YVAD-FMK)是FLICA 的成员之一，特异性的肽段序列Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD)使得它可以特异的与活化的Caspase-1 共价结合，从而检测细胞中活性的Caspase-1。

取浓度为 3×10～5×10/mL 的细胞悬液 300 μL制成样品。取1 支FAM-YVAD-FMK 溶解在50 μL的DMSO 中，制备成150～300 倍的储备液，分装置于-20 ℃保存。取1 支储备液用PBS 按1∶5 稀释后制成FAM-YVAD-FMK工作液，每290 μL样品加10 μL的工作液，37 ℃避光孵育1 h，每20 min 混匀1 次。用细胞洗涤缓冲液洗细胞两次，每次2 mL，200 g离心10 min。

采用流式细胞术检测时，细胞用300 μL 洗涤液缓冲液重悬置于冰上，过400目尼龙膜。采用488 nm的激光进行激发，配合530/30(FL-1/FITC channel)发射滤光片，PI 和FLICA(活化的Caspase-1)双阳性的细胞(位于第三象限)即为发生焦亡的细胞，数据分析采用Cellquest 3.0软件(BD公司)。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 单次大剂量X 射线照射HUVEC 后4 种细胞因子分泌水平的改变

10 Gy X 射线照射后 6～72 h，HUVEC 分泌的细胞因子IL-1β浓度明显上升(图1A)；照射组细胞分泌的IL-6 浓度在受照后12～48 h 高于对照组，并且在72 h 约升高为对照组的 2 倍(图 1B)；TNF-α的浓度，照射组在受照后6～72 h 均高于对照组，并且6 h 和12 h 两个时间点与对照组相比升高显著；IL-18 的浓度，照射组在受照后12～72 h 与对照组相比均明显升高，差异均有统计学意义(

P

＜0.05或

P

＜0.01)。

2.2 单次大剂量X射线照射对HUVEC内Caspase-1蛋白活化水平及细胞形态的影响

结果如图2显示，HUVEC接受单次10 Gy X射线照射后6～48 h，与对照组相比，各时间点6、12、24和48 h 的Cleaved Caspase-1 的表达量分别为对照组的1.43、1.52、2.82、1.47 倍，差异均有统计学意义(

P

＜0.05或

P

＜0.01)。

细胞焦亡的另一特征是，这种形式的死亡从细胞形态上类似于坏死，细胞在接受外源危险信号后，主要表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂。因此本研究采用透射电镜的方法，检测了细胞形态(图3)。结果显示，在同样的标尺下，受照细胞出现肿胀和细胞体积增大的现象，并显示出类坏死样的变化，这些都符合焦亡细胞的典型形态学改变。

2.3 单次大剂量和多次小剂量X 射线照射对HUVEC焦亡的影响

采用单次10 Gy 和多次小剂量(2.5 Gy/d，连续4 d)的两种照射形式分别对细胞进行处理，结合PIFLICA双染的流式细胞术检测受照后HUVEC的焦亡率(图4A)。根据统计显示(图4B)，单次大剂量照射组和多次小剂量照射组细胞的焦亡率均明显高于对照组[对照组焦亡率为(1.52±0.09)%；单次大剂量照射组焦亡率为(31.44±1.81)%；多次小剂量照射组焦亡率为(15.64±0.56)%；三组间比较，差异具有统计学意义(

P

＜0.01)]，说明单次大剂量和多次小剂量X射线照射均会引起HUVEC 焦亡率的增加；此外，单次大剂量(10 Gy)照射细胞的焦亡率明显高于多次小剂量(2.5 Gy/d，连续4 d)照射细胞(

P

＜0.01)。

图1 单次10 Gy X射线照射HUVEC后4种细胞因子分泌水平的变化

图2 单次10 Gy X射线照射HUVEC对Caspase-1活性蛋白表达的影响

图3 透射电镜下观察单次10 Gy X射线照射后HUVEC形态的变化

图4 单次大剂量和多次小剂量X射线照射对HUVEC焦亡的影响

3 讨 论

血管内皮细胞损伤是许多心脑血管疾病的病理基础。流行病学调查结果显示，电离辐射增加了心脑血管疾病的发病风险。因此，血管内皮细胞损伤在电离辐射防护领域引起了越来越多的关注。目前研究表明，电离辐射致血管内皮细胞损伤主要表现在细胞凋亡、细胞衰老、细胞因子的产生、血管凝血障碍、细胞代谢途径的改变和血管黏附分子的改变等方面。电离辐射对血管内皮的损伤可改变促炎和抗炎细胞因子的平衡，从而释放活性氧，还可以造成血管内皮细胞糖酵解、脂质代谢通路的失调，并破坏血管内皮细胞端粒功能或细胞内的免疫平衡。放射治疗后，X 射线照射引起的血管内皮损伤还能导致血小板聚集、炎症和血管重构，进而引起血管密度降低、缺血和纤维化。电离辐射引起的血管内皮细胞的急性损伤效应如果没有得到足够的补偿和调节，就可能触发受照机体内长期的血管功能障碍。因此，急需对电离辐射诱导的血管内皮细胞损伤机制进行研究，以期寻找到特定有效的分子靶点，采用药物进行干预从而减轻电离辐射引起的毒性效应。

目前，在电离辐射领域中对细胞焦亡的研究鲜见报道。现有报道指出，细胞焦亡是辐射致组织器官损伤的重要通路，并已在一些动物模型中证实，抑制细胞焦亡可达到缓解辐射损伤的作用。如Wu 等发现鞭毛蛋白A N/C可以抑制10 Gy Coγ射线诱导的活性氧的产生，降低炎症小体NLRP3的活性，从而减少放射性肠损伤模型小鼠体内小肠细胞焦亡的发生，并提出鞭毛蛋白A N/C可能是放射性肠损伤的潜在治疗手段；Liao 等报道，在接受头颈部放射治疗的患者中，常常发生放射性脑损伤，这主要与小胶质细胞的焦亡有关，他们进一步构建小鼠头部放射损伤模型发现间充质干细胞(MSCs)移植可减轻小胶质细胞焦亡；此外，Liu等也通过实验证实Coγ射线诱导巨噬细胞的焦亡，通过靶向调控Caspase-1 可以减少辐射引起的损伤。探讨X 射线诱发HUVEC 焦亡的分子机制，将为放射性血管内皮细胞损伤防治方法的研究提供新的思路和潜在的作用靶点。本研究发现：①在10 Gy X 射线照射后，与细胞焦亡相关的4 种细胞因子(IL-1β、IL-18、IL-6 和 TNF-α)均分泌增高；②HUVEC 中被剪切的 Caspase-1(P20)在 10 Gy X 射线照射后6～48 h的表达高于未照射组；③流式细胞术实验结果显示，10 Gy X 射线照射后72 h，发生焦亡的HUVEC百分率高于未照射组；④透射电子显微镜实验结果显示，10 Gy X 射线照射后72 h，HUVEC 肿胀和破裂。以上实验结果说明，X 射线照射能引起HUVEC 焦亡，并可能通过释放IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α等细胞因子引起炎性反应。

目前，构建放射性细胞损伤的模型主要有单次大剂量照射和多次小剂量照射两种方法。单次大剂量照射方案具有方便、快捷的优点，故被多数研究者采用。但临床患者的放射治疗多采用多次小剂量照射方案。因此，本研究检测了单次大剂量照射和多次小剂量照射对HUVEC 焦亡的影响。实验结果显示，单次大剂量照射(10 Gy)和多次小剂量照射(2.5 Gy/d，共4 d)组均会引起HUVEC焦亡的发生；此外，单次大剂量照射组细胞焦亡的比例明显高于多次小剂量分割照射组。有研究表明，多次小剂量的照射方案对正常组织损伤较小。如陈艳芳发现，采用X 射线单次大剂量照射大鼠全脑引起的损伤程度高于多次中等剂量照射组；此外，潘纯国等也报道，X 射线单次大剂量照射引起的小鼠放射性肺损伤和死亡率均高于多次照射组。本研究说明单次大剂量照射对人血管内皮细胞的损伤作用也强于多次小剂量分割照射。

综上所述，X射线照射引起HUVEC焦亡；在总剂量相同情况下，单次大剂量照射引起的细胞焦亡损伤水平，明显高于多次小剂量照射模式。抑制X射线诱导的细胞焦亡通路上的关键蛋白(如通路上游的炎症小体、焦亡执行分子Caspase-1 和下游效应分子Gasdermin 蛋白家族)可能减轻X 射线所致人血管内皮细胞损伤，但还需要进一步研究证实。