徐婧，徐豪明，周有连，彭瑶，赵冲，何杰，黄红丽，赵海兰，黄文琪，聂玉强

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种以反复腹痛、腹泻为特征的炎症性疾病，常呈慢性，主要包括克罗恩病(Crohn′s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)这两个类型。IBD的发病原因复杂，目前认为主要与遗传、环境、免疫和肠道菌群等有关。随着微生物-宿主相互作用的深入研究，大量研究表明益生菌或粪菌移植等菌群干预方法可调节宿主肠道菌群、改善肠道屏障功能，进而发挥疗效[1-4]。丁酸梭菌是一种以产丁酸为主要特点的专性厌氧菌，其产生的丁酸可直接为结肠细胞提供能量，缓解炎症症状[5]。在菌群失调诱导的小鼠腹泻模型中，丁酸梭菌可调节肠道菌群稳态，改善屏障功能和黏膜免疫细胞失调，促进小鼠恢复稳态[6]。在炎症性疾病和自身免疫病中核转录因子NF-κB发挥重要作用，激活后的NF-κB可转位入核，并显著上调如TNF-α、IL-6、IL-1β等众多促炎因子的表达，扩大机体炎症级联反应。此外，NF-κB抑制剂可明显减弱肠上皮屏障功能损害[7]。适当应用抗生素可抑制部分肠道致病菌的过度增长，也有研究证实粪菌移植前应用抗生素可增强移植后菌群的定植。本实验通过设置有无抗生素清肠预处理后葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)造模组，并给予丁酸梭菌干预。通过小鼠体质量、疾病活动指数、屏障改变情况和炎症因子表达情况等指标，观察联合抗生素预处理后丁酸梭菌对DSS诱导小鼠结肠炎疗效的作用，并初步探讨丁酸梭菌对于肠黏膜屏障保护的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性Balb/c小鼠购买于广东省医学实验动物中心(动物许可证号：SCXK[粤]2018-0002)，6～8周龄，体质量24～26 g，饲养于广州市第一人民医院动物实验室。

1.2 实验试剂

丁酸梭菌购于ATCC(ATCC 19398)；DSS购于美国MP biomedical公司；氨苄西林、万古霉素、新霉素、甲硝唑购自合肥博美生物科技有限责任公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、TB Green Premix Ex TaqⅡ(RR820A)购自日本Takara公司；兔抗鼠NF-κB p65单抗(#8242)、兔抗鼠磷酸化NF-κB p65单抗(#3033)、兔抗鼠IκBα单抗(#4812)和兔抗鼠磷酸化IκBα单抗(#2859)购自美国Cell Signaling TECHNOLOGY公司；兔抗鼠ZO-1多抗(ab216880)、兔抗鼠occludin多抗(ab168986)和兔抗鼠GAPDH单抗(ab181602)购自英国Abcam公司；羊抗兔HRP二抗(S0001)购自Affinity公司；小鼠ACTB内参引物购自上海生工公司(B661302-0001)。

1.3 肠炎小鼠模型的建立

进行1周的适应性饲养后，将30只小鼠随机分为5组，具体为空白组(Control)、DSS组(DSS)、抗生素清肠+DSS组(DSS+Antibiotic)、DSS+丁酸梭菌组(DSS+CB)和抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组(DSS+Antibiotic+CB)。抗生素清肠方案为：四联抗生素(氨苄西林1 g/L、新霉素1 g/L、万古霉素0.5 g/L、甲硝唑1 g/L)作为饮用水，待自由饮用7 d后更换为正常饮用水3 d，并循环3次。将3%(w/w)DSS添加到饮用水让小鼠自由饮用12 d，以构建急性结肠炎模型。每日据体质量下降程度、腹泻情况及血便情况评分，并按公式DAI=(体质量评分+腹泻评分+血便评分)/3计算DAI分数[8]。所培养出的丁酸梭菌活菌调整浓度为1×106CFU，于DSS造模期间用于干预组连续灌胃；空白组用等量生理盐水灌胃作为对照。于实验终点用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，颈椎脱臼法处死小鼠。新鲜结肠取出后分装于1.5 mL EP管，并快速放入液氮；取靠近肛门约1 cm的直肠进行石蜡包埋切片及HE染色，并进行评分[9]。

1.4 细菌培养

沾取丁酸梭菌菌液后于TSA固体培养基平板划线培养，并将该平板置于37 ℃温箱厌氧孵育24 h。待出现可视菌落后，将其挑出并培养于TSB液体培养基中，继而转移到37 ℃温箱厌氧培养14～16 h。待培养管底部出现3～5 mm乳白色沉淀时，将培养管以3 000 rpm/min转速在4 ℃下离心5 min收集菌体，PBS洗涤菌体3次后，调整菌液浓度为1×106CFU。

1.5 指标检测方法

1.5.1 RT-QPCR测定促炎因子表达水平 所用TNF-α、IL-1β因子引物由上海生工有限公司合成，具体序列为：TNF-α上游引物 5′-TTAGAAAGGGGATTATGGCTCA-3′，下游引物 5′-ACTCTCCCTTTGCAGAACTCAG-3′；IL-1β 上游引物 5′-AGAGCATCCAGCTTCAAATCTC-3′，下游引物 5′-CAGTTG-TCTAATGGGAACGTCA-3′。

用Trizol法提取组织总RNA，并据说明书使用Takara逆转录试剂进行cDNA的合成。QPCR的反应体系为10 μL SYBR Green Supermix，1 μL上游引物(10 μmol/L)，1 μL下游引物(10 μmol/L)，6 μL去离子水和2 μL的cDNA模板(50 ng/μL)。QPCR运行程序设定为95 ℃预变性20 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。确保每次结果中扩增产物溶解曲线为单峰，CT值在可信范围内。

1.5.2 免疫组织化学检测紧密连接蛋白表达 将已进行石蜡包埋切片的结肠组织依次进行脱蜡、修复、封闭，继而由一抗与抗原特异性结合形成免疫复合物，4°过夜，抗体浓度为ZO-1抗体(1∶200)、Occludin抗体(1∶1 000)；复温后孵育二抗40 min，用DAB显色剂进行显色，苏木素复染，封片镜检。结果判定：阳性细胞为管腔、隐窝上皮细胞膜和上皮细胞连接处呈棕黄色的细胞。据切片染色的强度和所判定阳性细胞百分比分别进行评分；两项相加为最终分数[10]。

1.5.3 Western-blot检测NF-κB通路表达 结肠组织经RIPA+PMSF裂解、匀浆后，测蛋白浓度，配制5%、8%聚丙烯凝胶，取总蛋白40 μg上样，电泳，PVDF转膜，脱脂奶粉封闭后孵育一抗，4 ℃过夜，抗体浓度为NF-κB(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)；复温后孵育二抗1.5 h；显像。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 丁酸梭菌可改善结肠炎大体

由图1可知，空白组小鼠体质量平稳增加，一般状况良好。给予DSS造模后，DSS组小鼠于第2天体质量下降，并出现精神萎靡、毛发粗糙，以及肉眼血便、大便不成形等结肠炎表现；给予丁酸梭菌干预后，DSS+丁酸梭菌组小鼠体质量及一般状况较DSS组稍缓解。给予DSS造模后，抗生素清肠+DSS组小鼠体质量从第2天起略微下降，自第7天起下降不明显；但给予丁酸梭菌干预后，抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组小鼠体质量逐渐增加。

由图1可知，实验终点时，空白组小鼠疾病活动度趋近于0。DSS组小鼠DAI显著增高(P<0.001)，给予丁酸梭菌干预后DAI降低。与空白组比较，抗生素清肠+DSS组DAI显著增加(P<0.001)，而丁酸梭菌干预可明显降低其DAI(P<0.01)。总的来说，抗生素清肠可加强丁酸梭菌降低DAI的效果。

图1 各组小鼠体质量及末次DAI评分 A：体质量；B：末次DAI评分(**P<0.01，***P<0.001)

2.2 丁酸梭菌改善结肠炎小鼠肠道病理

由图2可知，光镜下空白组小鼠结肠黏膜结构完整，腺体排列整齐，可见大量杯状细胞，黏膜固有层及黏膜下层未见明显免疫细胞浸润。DSS组及抗生素清肠+DSS组小鼠结肠黏膜结构破坏，腺体消失，黏膜固有层及黏膜下层出现大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润；DSS组严重程度大于抗生素清肠+DSS组。给予丁酸梭菌干预后，干预组小鼠结肠黏膜结构较完整，腺体破损及免疫细胞浸润缓解，可见杯状细胞；抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组小鼠结肠病理程度较DSS+丁酸梭菌组轻。

图2 各组小鼠结肠HE染色和病理评分 A：空白组；B：DSS组；C：DSS+抗生素清肠组；D：DSS+丁酸梭菌组；E：DSS+抗生素清肠组+丁酸梭菌组；F：组织病理评分(*P<0.05, ** P<0.01)

据结肠黏膜损伤程度和炎性细胞浸润程度进行评分，可见与空白组相比，DSS组和抗生素清肠+DSS组病理评分显著升高，且DSS组病理评分高于抗生素清肠+DSS组。给予丁酸梭菌干预后，DSS+丁酸梭菌组较DSS组病理评分降低(P<0.05)，抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组较抗生素清肠+DSS组病理评分均减低(P<0.01)，且后者病理评分较前者下降程度更高。

2.3 丁酸梭菌缓解肠道屏障损伤

ZO-1和occludin是重要的肠道屏障紧密连接蛋白，可间接反映肠屏障损害程度；其表达程度越高，屏障修复和抵御外界损伤能力越强[11]。如图3所示，空白组小鼠结肠ZO-1表达显著，其表达多位于管腔上皮细胞、隐窝上皮细胞、上皮细胞连接处顶端。与空白组相比，DSS组及抗生素清肠+DSS组ZO-1表达明显减少，DSS组ZO-1表达减少程度重于抗生素清肠+DSS组。给予丁酸梭菌干预后，干预组管腔上皮细胞及隐窝上皮细胞ZO-1表达增强，且抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组表达增强最显著。据染色强度和炎性细胞所占百分比进行评分，可见DSS组和抗生素清肠+DSS组ZO-1表达评分明显降低(P<0.001；P<0.05)，而丁酸梭菌干预组评分均升高(P<0.05)。抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组评分在干预组中最高。

图3 各组小鼠结肠ZO-1免疫组化染色及评分 A： 空白组；B：DSS组； C：DSS+抗生素清肠组； D：DSS+丁酸梭菌组； E：DSS+抗生素清肠组+丁酸梭菌组； F：免疫组化评分(*P<0.05, *** P<0.001)

如图4所示，occludin在空白组的管腔上皮细胞、隐窝上皮细胞及上皮细胞连接处顶端均可观察到表达，DSS组对比空白组其表达减少，抗生素清肠+DSS组occludin表达稍减少。给予丁酸梭菌干预后，干预组occludin表达增高(P<0.05)，其表达多位于管腔上皮细胞、隐窝上皮细胞、上皮细胞连接处顶端及少部分胞浆，且抗生素清肠后的抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组表达程度增高更明显。从免疫组化评分来看，DSS组和抗生素清肠+DSS组评分较空白组明显降低(P<0.001；P<0.05)，DSS组降低程度更显著。给予丁酸梭菌干预后，DSS+丁酸梭菌组和抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组评分增加(P<0.05)。抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组评分为干预组中最高。

图4 各组小鼠结肠occludin免疫组化染色及评分 A： 空白组；B：DSS组； C：DSS+抗生素清肠组； D：DSS+丁酸梭菌组； E：DSS+抗生素清肠组+丁酸梭菌组； F：免疫组化评分(*P<0.05, *** P<0.001)

2.4 丁酸梭菌下调促炎因子表达

据图5可知，与空白组比较，DSS组和抗生素清肠+DSS组促炎因子TNF-α的相对表达增加，而DSS组增加更为明显 (P<0.001)。给予丁酸梭菌干预后，干预组TNF-α相对表达量均下降，DSS+丁酸梭菌组TNF-α表达下调具有统计学差异(P<0.01)；抗生素清肠+DSS+丁酸梭菌组其TNF-α的相对表达量最低。促炎因子IL-1β在DSS组的相对表达量明显增高(P<0.01)，给予丁酸梭菌干预后的DSS+丁酸梭菌组其表达显著下降；但抗生素清肠后的抗生素清肠+DSS组IL-1β表达未见明显升高。

图5 小鼠结肠TNF-α和IL-1β相对表达量 A： TNF-α；B：IL-1β (*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.5 丁酸梭菌作用与NF-κB通路相关

如图6所示，从P65表达情况来看，DSS组表达略低于空白组，两者差异不大；抗生素清肠+DSS组表达降低较明显(P<0.001)。DSS+丁酸梭菌组表达低于DSS组，差异均具有统计学意义(P<0.001)。与DSS+抗生素清肠组比较，DSS+抗生素清肠+丁酸梭菌组表达明显低于DSS+抗生素清肠组，且差异具统计学意义(P<0.001)。从磷酸化P65表达情况来看，DSS组和抗生素清肠+DSS组表达明显高于空白组，其差异具有统计学意义(P<0.001)。与DSS组相比，DSS+丁酸梭菌组表达低于DSS组，差异均具有统计学意义(P<0.001)。与DSS+抗生素清肠组比较，DSS+抗生素清肠+丁酸梭菌组表达略升高，且差异具统计学意义(P<0.01)。从IκBα表达情况来看，DSS组表达低于空白组，其差异不具有统计学意义；抗生素清肠+DSS组表达略高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)。与DSS组相比，DSS+丁酸梭菌组表达高于DSS组，差异具有统计学意义(P<0.001)。与DSS+抗生素清肠组比较，DSS+抗生素清肠+丁酸梭菌组表达明显高于DSS+抗生素清肠组，差异具统计学意义(P<0.001)。从磷酸化IκBα表达情况来看，DSS组和抗生素清肠+DSS组表达明显高于空白组，其差异均具有统计学意义(P<0.001)。与DSS组相比，DSS+丁酸梭菌组表达低于DSS组，差异均具有统计学意义(P<0.001)。与DSS+抗生素清肠组比较，DSS+抗生素清肠+丁酸梭菌组表达明显低于DSS+抗生素清肠组，差异具统计学意义(P<0.001)。

图6 小鼠结肠NF-κB通路表达情况 A：Western blot图；B：各蛋白相对表达量(*P<0.05，**P<0.01, *** P<0.001)

2.6 紧密连接蛋白与NF-κB通路之间的相关性分析

如图7所示，将紧密连接蛋白ZO-1和occludin与P65、IκBα及磷酸化的P65、IκBα做相关性分析显示，ZO-1与IκBα存在正相关，occludin与IκBα、P65存在正相关，其相关性无统计学差异；而ZO-1和occludin与磷酸化的P65(ZO-1：P<0.05；occludin：P<0.01)、IκBα(ZO-1：P<0.01)存在负相关。

图7 紧密连接蛋白与NF-κB通路相关性分析

3 讨论

IBD是一种慢性炎症性疾病。对IBD的传统治疗主要包括水杨酸制剂药物、糖皮质激素和免疫抑制剂等，虽然可以控制炎症、调节免疫以缓解IBD症状，但是存在复发率高、缓解率低等缺点。目前，IBD的菌群治疗已成为IBD治疗十分重要的一部分[12]，而丁酸梭菌属于益生菌的一种，对IBD的治疗也发挥着作用。利用DSS诱导的小鼠肠炎模型是IBD的经典动物模型。本实验中，DSS组小鼠出现精神萎靡、体质量下降、大便形状改变、排血便等结肠炎表现；光镜下见结肠组织出现黏膜结构紊乱、上皮破损和大量免疫细胞浸润，表明结肠炎模型构建成功。

越来越多的研究表明抗生素清肠准备对于菌群研究和临床实践具有重要意义，如伪无菌小鼠模型以及粪菌移植前提倡的抗生素肠道准备[13-14]。本研究发现，丁酸梭菌干预可以改善模型组小鼠体质量下降，降低疾病活动度，并缓解小鼠肠黏膜损伤和免疫细胞浸润；抗生素清肠预处理后，丁酸梭菌对于体质量、疾病活动度和结肠病理的缓解更显著。抗生素清肠组小鼠体质量变化不明显可能与万古霉素的特殊气味有关[15-17]。这导致清肠期间小鼠每日饮用水量下降，体质量下降明显，而恢复正常饮水或含DSS的饮用水后小鼠体质量较前上升或较预期下降不明显。

肠上皮细胞和黏液组成的肠黏膜屏障是肠道抵抗外来病原菌的第一道防线[18]。在炎症发生时，病原菌可产生大量促炎因子损伤肠黏膜屏障，继而诱发扩大全身炎症反应。而丁酸梭菌具有产丁酸特性，其产生的丁酸为结肠上皮细胞提供能量，并具备抗炎作用[19]。在本实验中，DSS组小鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1、occludin表达明显降低，而丁酸梭菌干预可有效升高紧密连接蛋白表达，缓解肠黏膜屏障损伤。除此之外，与未使用抗生素清肠组比，使用抗生素清肠后的DSS模型组肠屏障损伤较轻，丁酸梭菌缓解效果更明显。这表明丁酸梭菌活菌能够减轻肠黏膜屏障损伤，并在抗生素清肠的情况下发挥更明显的屏障保护作用。有研究提出抗生素清洁肠道后再进行粪菌移植，可更有利于益生微生物定植于患者肠道，并利用与病原菌的竞争可达到更好的粪菌移植效果[20]。本实验中，抗生素清肠预处理后丁酸梭菌维持肠屏障作用增强，原因可能为由于抗生素清肠去除了大部分共生菌和条件致病菌，更利于丁酸梭菌的定植和释放丁酸，从而修复和维持肠上皮屏障。

核转录因子NF-κB广泛存在于真核细胞中，该二聚体由NFKB1(P50)和RelA(P65)这两个分子组成，常被IκB抑制并以非活化的状态存在于细胞质[21]。当受到某些促炎因子或脂多糖刺激后，抑制剂IκB将被磷酸化继而降解，释放出NF-κB复合体入核，从而发挥调节基因表达和介导炎症和自身免疫病的作用[22-23]。在AOM/DSS诱导的小鼠炎癌模型中，丁酸梭菌及所产生的短链脂肪酸可以有效减低小鼠NF-κB的表达[6, 24]，从而缓解症状和调节抗肿瘤免疫。除此之外，在UC患者的结肠黏膜上皮和黏膜固有层可检测到NF-κB表达增加，众多促炎因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等均可通过增加NF-κB的表达，进而加剧炎症反应[25]。与以往研究相符，丁酸梭菌可以降低促炎因子TNF-α和IL-1β表达，磷酸化的P65及IκBα的表达同样被下调；抗生素清肠预处理后，虽然磷酸化IκBα表达在丁酸梭菌组被下调，但是丁酸梭菌下调磷酸化P65表达的效果并不明显。这个现象说明丁酸梭菌可能通过抑制磷酸化IκBα的表达，恢复IκBα的作用，从而达到抑制NF-κB通路及TNF-α、IL-1β表达、缓解炎症的效果；而抗生素清肠预处理对磷酸化P65的改变不符合预期，可能因为其加强丁酸梭菌的作用不涉及NF-κB通路，我们还需要进一步的NF-κB入核和定位实验来确认这一结论。NF-κB的活性形式主要为被磷酸化后由胞浆转移到胞核，而本实验检测到总蛋白未磷酸化NF-κB在模型组中表达略有下调，丁酸梭菌干预后其改变不明显，可能由于所提取的是整个细胞的总NF-κB，变化无明显趋势。此外，在本研究中，紧密连接蛋白表达与NF-κB和IκBα表达存在正相关，而与磷酸化的NF-κB和IκBα表达存在负相关，说明NF-κB通路可能参与黏膜屏障表达调控。但是丁酸梭菌是否通过抑制NF-κB通路进而发挥缓解结肠炎作用，仍需进一步研究证实。

综上所述，在DSS诱导的小鼠肠炎模型中，丁酸梭菌可以缓解小鼠大体症状及修复屏障损伤，其机制可能与NF-κB相关；抗生素清肠预处理可以增加其疗效，但对NF-κB通路的影响不大。本文仍存在一些不足：①本研究所阐述的可能机制仅为相关性。对于丁酸梭菌是否通过直接影响NF-κB起作用及作用方式并不明确，仍需要更多的实验加以阐述；②本研究使用的菌株为单一模式菌株，所展现出的作用对宿主可能具有菌株特异性，若要进行后续研究和应用需明确菌株。总之，本研究探讨了丁酸梭菌对于肠炎小鼠粘膜屏障和NF-κB通路的改变，并初步探讨了丁酸梭菌发挥抗炎作用的机制，但具体直接作用机制仍待进一步研究。