王璠,张莉

胃癌是世界上高发的恶性肿瘤之一，死亡率高，肿瘤的发生、发展是一个多因素、多阶段、多基因变异的综合病变过程[1]。现代中医学家认为脏腑阴阳失调、气滞血瘀、肺气抑郁等是多种癌症发生的主要病因[2]。因此，应该以扶正培本、清热解毒、活血化瘀为中医药治疗癌症的基本原则。大黄酸(Rhein)是廖科植物药用大黄的主要成分之一，具有抗肿瘤[3]、抗菌[4]、免疫抑制[5]、抗炎[6]等活性。研究表明大黄酸对于肝癌[7]、宫颈癌[8]等都有一定的抑制作用，但是大黄酸对于胃癌细胞生物学行为的影响研究甚少，故本研究将分析大黄酸对人胃癌细胞(SGC-7901)增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901(CL-0206)购于武汉普诺生命科技有限公司；大黄酸(R24531，HPLC≥95%)购于上海吉至生化科技有限公司；细胞培养基RPMI-1640(PM150110)、胎牛血清(164210-500)均购于上海雅吉生物科技有限公司；胰蛋白酶(T4049)购于Sigma；Lipo6000TM转染试剂(C0526)、CCK-8试剂盒(C0038)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062M)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)购于碧云天生物科技有限公司；逆转录试剂盒(RR037A)、荧光定量PCR检测试剂盒(DRR096A)购于大连宝生物工程有限公司；FSCN1-3′ UTR WT和FSCN1-3′ UTR MUT由昆明擎科生物有限公司设计并合成；miR-29c-3p mimics及NC mimics、miR-29c-3p inhibitor及NC inhibitor由上海吉玛制药公司设计并合成。GAPDH(AF5009)抗体购于碧云天生物；FSCN1抗体(D120251)购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 细胞培养

SGC-7901细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养，然后取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞转染

取处于对数生长期的SGC-7901细胞(密度为2×105cells/孔)接种于6孔板中，实验分组为：①NC组、miR-29c-3p mimics组、NC mimics组；②Rhein组、Rhein+miR-29c-3p inhibitor组、Rhein +NC inhibitor组；③野生型质粒对照组(转染NC mimics和FSCN1-3′ UTR WT)、野生型实验组(转染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR WT)、突变型质粒对照组(转染mimics-NC和FSCN1-3′UTR MUT)、突变型质粒实验组(转染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR MUT)。

按照实验设计分别转染至SGC-7901细胞，分别用100 μL无血清RPMI-1640培养基稀释5 μL Lipo6000TM转染试剂和8 μL转染物，室温静置5 min后混合，再室温静置5 min。将混合物均匀滴加到孔内，并轻轻混匀。8 h后更换完全培养基，置于培养箱中培养48 h。

1.4 qRT-PCR

通过Trizol法分离得到SGC-7901细胞总RNA，然后逆转录为cDNA，通过SYBR Green定量PCR试剂盒在7500仪器上进行qRT-PCR，使用2-ΔΔCt法计算miR-29c-3p的相对表达。具体引物序列如表1所示。

1.5 CCK-8实验检测细胞的增殖活性

取处于对数生长期的SGC-7901细胞(密度为2×103cells/孔)接种于96孔板中，进行大黄酸处理或转染NC/miR-29c-3p mimics、NC/miR-29c-3p inhibitor后，培养0、24、48、72 h测定各孔的吸光值(每孔加入20 μL CCK-8试剂，在37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养4 h，使用酶标仪测定吸光度值)。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

取处于对数生长期的SGC-7901细胞接种于24孔板中，细胞密度为2×104cells/孔。在在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养24 h。使用0.1%结晶紫染色10 min，1×PBS清洗后，随机选择5个视野，计数下室染色细胞，并评估细胞迁移能力。

将提前冻存的Matrigel胶置于4 ℃直至溶成液态，使用400 μL无血清培养基对50 μL Matrigel胶原液进行稀释并轻轻摇晃混匀。取50 μL稀释液加至向Transwell小室的上室中,置于37 ℃培养箱中进行孵育，当凝固后加入100 μL无血清培养基浸润凝胶，吸弃。

取处于对数生长期的SGC-7901细胞接种于24孔板中，细胞密度为2×104cells/孔。然后取细胞悬液100 μL加至Transwell小室上层，Transwell小室下层中加入500 μL 10%血清完全培养基，37 ℃培养箱中避光培养48 h后取出小室，使用0.1%结晶紫染色10 min，1×PBS清洗后，随机选择5个视野，计数下室染色细胞。通过计数穿膜细胞数来反应细胞侵袭能力。

1.7 流式细胞术和Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡

取处于生长期的SGC-7901细胞至6孔板中，进行处理或转染后培养48 h。然后收集细胞，加入500 μL的1×bingding buffer对细胞进行重悬，再加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI并轻轻摇晃混匀，室温孵育10 min后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡并统计细胞凋亡率。

1.8 双荧光素酶报告基因检测实验

取处于对数生长期的SGC-7901细胞制备成单细胞悬液，接种于96孔板，采用Lipo6000TM转染试剂按说明书操作进行共转染。将细胞分为以下四组：①野生型质粒对照组(转染NC mimics和FSCN1-3′ UTR WT)；②野生型实验组(转染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR WT)；③突变型质粒对照组(转染mimics-NC和FSCN1-3′ UTR MUT)；④突变型质粒实验组(转染miR-29c-3p mimics和FSCN1-3′ UTR MUT)。对其培养24 h后裂解细胞，并按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。。

1.9 Western blot检测FSCN1蛋白表达情况

收集大黄酸处理或转染NC/miR-29c-3p mimics、NC/miR-29c-3p inhibitor的细胞，使用细胞裂解液对细胞进行裂解，然后使用BCA法测定蛋白浓度。按照各样品30 μg蛋白的上样量进行上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉封闭1 h，洗膜。加入相应的一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育，洗膜后，加入二抗(1∶3 000)，室温孵育1 h。清洗膜后，加入ECL发光液显影。

1.10 统计方法

2 结果

2.1 大黄酸对人胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移、侵袭的影响

CCK-8实验结果(图1A)显示，与对照组相比较，大黄酸处理24 h、48 h、72 h对细胞增殖具有一定的抑制作用，并具时间依赖性，差异具有统计学意义(P<0.01)。同时，随着大黄酸处理浓度的增加，增殖速率显著降低，具有一定的剂量依赖性，为此选择50 μM大黄酸处理48 h进行后续实验。Transwell侵袭实验结果(图2B、C)显示，与对照组相比较，不同浓度的大黄酸处理，细胞的迁移能力、侵袭能力显著降低，具有浓度依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 大黄酸对人胃癌细胞中miR-29c-3p表达、凋亡的影响

qRT-PCR结果(图2A)显示，与对照组相比较，大黄酸处理后细胞中miR-29c-3p表达上升，且随着大黄酸浓度的增加，miR-29c-3p表达上升，差异具有统计学意义(P<0.01)。

流式细胞术和Annexin V-FITC/PI检测结果(图2B)显示，与对照组相比较，大黄酸处理后，细胞凋亡率上升，且随着浓度的增加，凋亡率显著上升，差异具有统计学意义(P<0.001)。

图2 大黄酸对人胃癌细胞SGC-7901中miR-29c-3p表达、凋亡的影响 A：qRT-PCR检测miR-29c-3p在细胞中的表达水平；B：流式细胞术检测细胞凋亡率。与大黄酸(0 μM)组比较，**P<0.01，***P<0.001

2.3 过表达miR-29c-3p对人胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

与对照组相比较，miR-29c-3p mimics组中miR-29c-3p表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；而对照组与NC mimics组中miR-29c-3p表达变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3A。CCK-8实验结果(图3B)显示，与对照组相比较，处理24 h、48 h、72 h后miR-29c-3p mimics组中细胞增殖率下降(P<0.001)，具有时间依赖性，而对照组与NC mimics组间差异不明显。Transwell实验结果(图3C、D)显示，与对照组相比较，miR-29c-3p mimics组中细胞迁移和侵袭能力均降低，差异具有统计学意义(P<0.001)，而对照组与NC mimics组间差异不明显。流式细胞术和Annexin V-FITC/PI检测结果(图3E)显示，与对照组相比较，miR-29c-3p mimics组中细胞凋亡率增加，而对照组与NC mimics组间差异不明显。

图3 过表达miR-29c-3p对SGC-7901细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响 A：qRT-PCR检测miR-29c-3p在细胞中的表达水平；B:CCK-8试验检测细胞增殖能力；C、D：Transwell试验检测细胞迁移和侵袭能力；E:流式细胞术检测细胞凋亡率。与正常对照组比较，**P<0.01，***P<0.001

2.4 抑制miR-29c-3p后大黄酸对人胃癌细胞增殖、凋亡的影响

qRT-PCR检测结果(图4A)显示，与Rhein组相比较，Rhein+miR-29c-3p inhibitor组中miR-29c-3p表达量降低(P<0.01)，而Rhein组与Rhein +NC inhibitor组差异不明显。CCK-8实验检测结果(图4B)显示，与Rhein组相比较，处理24 h、48 h、72 h后Rhein +miR-29c-3p inhibitor组中细胞增殖率升高(P<0.05)，而Rhein组与Rhein +NC inhibitor组差异不明显。

图4 抑制miR-29c-3p后大黄酸对SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响 A： qRT-PCR检测miR-29c-3p在细胞中的表达水平；B：CCK-8检测细胞增殖能力；C：流式细胞仪检测细胞凋亡率。与大黄酸组比较，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001

流式细胞术和Annexin V-FITC/PI实验结果(图4C)显示，与Rhein组相比较，Rhein +miR-29c-3p inhibitor组中细胞细胞凋亡率降低，差异具有统计学意义(P<0.001)，而Rhein组与Rhein +NC inhibitor组差异不明显，这表明在细胞中抑制miR-29c-3p表达能够逆转大黄酸处理引起的细胞增殖和凋亡等生物学行为。

2.5 miR-29c-3p靶向调控FSCN1表达

通过Starbase数据库预测到FSCN1的3′UTR与miR-29c-3p存在互补区域(图5A)。双荧光素酶报告基因活性检测实验分析显示，与NC mimics组相比较，miR-29c-3p mimics组中miR-29c-3p能够显著性降低转染FSCN1 3′ UTR WT细胞中的荧光素酶强度(P<0.01)，而转染FSCN1 3′ UTR MUT细胞中的荧光素酶强度并没有改变(图5B)。Western blot检测结果(图5C)显示，与对照组相比较，在miR-29c-3p mimics组中FSCN1表达显著降低(P<0.01)。这表明miR-29c-3p可靶向调控FSCN1的表达。

图5 miR-29c-3p靶向调控FSCN1表达 A：FSCN1与miR-29c-3p互补结合位点；B：双荧光素酶报告基因实验，验证miR-29c-3p与FSCN1的靶向关系；C：免疫印迹法检测FSCN1蛋白表达。与正常对照组比较，**P<0.01

2.6 大黄酸对人胃癌细胞中FSCN1表达的影响

Western blot检测结果显示，与Rhein组相比较，Rhein+miR-29c-3p inhibitor组中FSCN1蛋白表达量增加，差异具有统计学意义(P<0.01)，而Rhein组与Rhein+NC inhibitor组差异不明显(图6)。

图6 免疫印迹法检测大黄酸对SGC-7901细胞中FSCN1表达的影响 与大黄酸组比较，**P<0.01

3 讨论

胃癌是世界范围内的常见的恶性肿瘤之一，其发病率高、死亡率高，与多种因素有关[9]。临床上常用顺铂、培美曲塞、奥沙利铂、多西紫杉醇、氟尿嘧啶等，但具有一定的副作用[10-11]。临床上常使用中药辅助治疗癌症，例如，羟基喜树碱[12]、人参皂苷Rh2[13]、四藤方[14]、蛇六谷[15]、山慈菇[16]等。

中药大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效[17]。大黄酸来源于大黄，是廖科大黄属植物的根茎中的活性成分，属于蒽醌类[18]。近年来，对于这些植物的药理研究已从传统的免疫学领域扩展至肿瘤治疗方面，并进一步探究其诱导肿瘤细胞增殖和凋亡的机理。大黄酸能够提高细胞中Ca2+含量，使得线粒体膜电位降低，激活线粒体内很多信号通路，促进细胞凋亡[19]。大黄酸可通过Rac1/LIMK1/cofilin信号通路有效抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移[20]。本研究结果显示大黄酸能够显著抑制人胃癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，表明大黄酸具有抗癌作用，能够抑制人胃癌细胞的发生、发展，与在卵巢癌[21]、宫颈癌[22]等肿瘤细胞中的研究结果相一致。

MicroRNA是一种高度保守的内源性非编码蛋白质的小RNAs(约为22个核苷酸)，能够结合到mRNA的3′UTR端来发挥其负调控基因表达的作用[23]。现已证实，miRNA与肿瘤的发生发展具有紧密的联系，例如细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等[24]。miR-29c-3p/KIAA1199轴通过与WBP11和PTP4A3结合来调节胃癌的迁移[25]。Dong等研究发现血红素碱通过调节miR-96-5p/miR-29c-3p和MAPK/JNK信号通路抑制BGC-823胃癌细胞的增殖[26]。Chen等研究发现miR-29c-3p的过表达可抑制Akt3在P19胚胎癌细胞中的增殖，促进其凋亡和分化[27]。本研究中采用人胃癌SGC-7901细胞进一步进行实验证实，过表达miR-29c-3p能够促进细胞增殖、迁移和侵袭并且抑制细胞凋亡。当抑制细胞中miR-29c-3p的表达后，然后使用大黄酸进行处理，引起细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡。这表明miR-29c-3p过表达能够抑制人胃癌SGC-7901细胞的生物学功能。

miR-29c-3p是miR-29家族的重要成员，在多种肿瘤中处于低表达状态[25,27]。通过Starbase数据库预测到miR-29c-3p能够靶向调控FSCN1。FSCN1在人乳腺癌[28]、胃肠道肿瘤[29]、肺癌[30]和卵巢癌[31]中高表达。在乳腺癌细胞中FSCN1的表达与侵袭性的生物学行为相关[32]。猜测miR-29c-3p可能通过靶向FSCN1来发挥抑癌作用。

综上所述，大黄酸能够参与人胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡能力，其具体机制为大黄酸通过上调miR-29c-3p的表达，降低FSCN1蛋白表达，进而抑制胃癌细胞的生物学行为，后续将进一步进行动物实验研究，为开发抗胃癌药物提供科学的理论基础。