罗鹏 郑远 葛海峰

[摘要] 目的 采用液相色譜-质谱联用技术的代谢组学方法，探讨非创伤性股骨头坏死（NONFH）患者血浆来源微泡的生物标志物，为NONFH的诊断提供依据。 方法 选取2020年5—11月温州医科大学附属第二医院收治的20例NONFH患者及配对的20名健康体检者的血浆样本，分离微泡，并采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱法分析微泡中代谢物，结合主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘分辨分析法（OPLS-DA）筛选差异性代谢产物。结果 样本中共鉴定出12种差异性代谢产物，其中肌苷、次黄嘌呤、尿酸及花生四烯酸上调（P<0.05）;半胱氨酸、同型半胱氨酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）和硫酸孕烯醇酮下调（P<0.05）。 结论 采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱法分析NONFH血浆来源微泡的代谢产物是可行的，为NONFH的筛查提供新的参考依据。

[关键词] 股骨头坏死;微泡;代谢组学;创伤

[中图分类号] R681.8          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）35-0032-05

Metabonomics study of plasma-derived microvesicles in patients with non-traumatic necrosis of the femoral head

LUO Peng1   ZHENG Yuan2   GE Haifeng3

1.Department of Orthopedics，the Second Affiliated Hospital and  Children′s Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000，China; 2.The Second School of Medicine of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000， China; 3.Department of Laboratory Medicine，the Second Affiliated Hospital and Children′s Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou   325000，China

[Abstract] Objective To explore the biomarkers of plasma-derived microvesicles from patients with non-traumatic necrosis of the femoral head （NONFH） by using the metabonomics method of liquid chromatography-mass spectrometry， and to provide a basis for the diagnosis of NONFH. Methods A total of 20 patients with NONFH and 20 matched healthy subjects who were admitted to the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University From May to November 2020 were selected. The microbubbles were separated. The metabolites in microvesicles were analyzed using ultra-high performance liquid chromatography tandem time of flight mass spectrometry. The differential metabolites were screened combined with principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares resolution analysis （OPLS-DA）. Results A total of 12 different metabolites were identified in the sample， of which inosine，hypoxanthine，uric acid and arachidonic acid were up-regulated （P<0.05）;cysteine，homocysteine，pyruvate，malic acid，α-ketoglutarate， dehydroepiandrosterone sulfate （DHEA-S） and pregnenolone sulfate were down-regulated（P<0.05）. Conclusion It is feasible to analyze the metabolites of NONFH plasma-derived microbubbles by ultra-high performance liquid chromatography tandem time-of-flight mass spectrometry，which provides a new reference basis for NONFH screening.

[Key words] Femoral head necrosis; Microvesicles; Metabolomics; Trauma

非創伤性股骨头坏死（Non traumatic osteonecrosis of the femoral head，NONFH）常与长期、大剂量或不规范使用糖皮质激素、大量酗酒等有关，约占股骨头坏死总数的70%～80%[1]。现有的多种影像学方法虽使得NONFH的早期诊断率得以提升，但各类影像学方法仍存在缺陷，使得该病的早期诊断依旧困难重重。微泡（Microvesicles，MVs）是一组由多种细胞在生理和病理状态下释放的，直径在100～1000 nm之间的异质性膜囊泡[2]。近年来，随着研究的深入，人们逐渐认识到微泡在疾病诊断、预后及个性化治疗方面具有广阔的医学应用前景[3]。本研究采用代谢组学的方法对健康人群及非创伤性股骨头坏死患者血浆来源的微泡进行分析，找寻差异性代谢产物，筛选出潜在的生物标记物，为疾病的诊断提供新的依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年5—11月在温州医科大学附属第二医院诊治的NONFH患者（NONFH组）和按年龄、性别及身高配对的健康体检者（对照组），每组各20例，血样分别由本院骨科和体检中心提供，所有参与者均同意并签署研究方案的知情同意书。本研究已经我院医学伦理委员会审核通过。NONFH组患者的纳入标准：①参照国际骨循环研究会（Asociation research circulation osseous，ARCO）诊断标准[4-5]，经X线和磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）确诊为NONFH，且ARCO分期为Ⅲ或Ⅳ级;②年龄30～70岁。NONFH组患者的排除标准：①有髋部外伤及手术史者;②有代谢性骨病的病史，包括严重的骨质疏松症、骨肿瘤，伴有骨转移的恶性肿瘤、甲状旁腺功能亢进或甲减、Paget病或肾性骨营养不良等;③不同意参加该研究项目者。健康体检者的纳入标准：①相同时间段就诊的体检者;②年龄30～70岁;③体检未发现基础性疾病者;④同意参加该项目者。

1.2 仪器与试剂

仪器：高速冷冻离心机（型号5810R）购于德国Eppendorf公司;JEM-1200EX电子显微镜购于日本JEOL公司;Nanosight 300系统购于英国Malvern Panalytical公司;Waters Xevo G2XS Q-TOF，色谱柱Acquity UPLC HSS T3 column （Waters，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）及数据分析软件Progensis QI均购于上海沃特世公司;CD63、TSGl01抗体、PBS（Phosphate-buffered saline）、PBST（Phosphate-buffered saline with Tween 20）、RIPA（Radioimmunoprecipitation assay buffer）裂解液均购于美国Thermo Fisher Scientific公司;甲醇、乙腈、甲酸、氯仿均购于上海Sigma试剂公司、超纯水仪购于上海Milli-Q公司。

1.3 血浆标本采集及储存

采集血液前一晚禁食（22：00开始），次日早晨8时（早餐前）从NONFH组患者和对照组受试者获得血液样品，将血液标本置于5000×g离心机下离心20 min，取上清（血浆），装入新的离心管，并置于-80℃冰箱中储存以免代谢物衰减。

1.4 微泡的分离

为了最大程度地减少溶剂提取之前血浆样本中代谢物成分的变化，将所有冻融血浆样本在室温下于冰上融化25 min。随后将样品置于离心管中，在4℃下以17 000×g离心90 min，弃上清，将沉淀物用PBS重悬，再次以17 000×g离心90 min（4℃）分离出MVs。

1.5 微泡的鉴定

1.5.1 透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）  取重悬于PBS中的MVs 20 μL滴置在Formvar—碳涂层的网格（200孔）上吸附10 min，风干后，使用2%磷钨酸溶液染色2 min后，采用JEM-1200EX电子显微镜在60 kV电压下检查样品。

1.5.2 Nanosight Tracking  通过使用配备有快速视频捕获和粒子跟踪软件的Nanosight 300系统测量布朗运动来确定分离制剂中存在颗粒的粒径分布。所有样品采集后设置均保持相同，并对每个视频进行分析以给出均值和中位数值来表示囊泡大小及颗粒浓度的估算值。

1.5.3 Western blot  用RIPA缓冲液裂解MVs，并进行超声混匀。然后，在10% SDS-PAGE上分离蛋白，并使其转到PVDF（Polyvinylidene fluoride）膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h后，PBST稀释的一抗CD63（1∶1 000）、TSGl01（1∶500）在4℃下孵育过夜;用PBST洗涤3次后，将膜与相应二抗在室温下孵育2 h，用增强的化学发光试剂Western Pico将免疫反应蛋白条带可视化，然后在电泳凝胶成像分析系统上成像。

1.6 代谢物提取

将微泡重悬于100 μL水中，2次冻融后超声裂解并保存在冰上。每个样本加入100 μL预冷的水及267 μL预冷甲醇，涡旋震荡1 min。随后在4℃下以13 000×g离心10 min，吸取全部上清移至新的EP管中，加入533 μL氯仿，涡旋震荡10 s。相同条件下再次离心5 min，吸取350 μL上层溶液至新的EP管中，氮气吹干，加入100 μL 50∶50 甲醇水复溶，涡旋震荡10 s，通过0.45 μM滤膜过滤，转移至色谱瓶，准备进样。

1.7 液质联用分析方法

1.7.1 色谱条件  色谱柱：Acquity UPLC HSS T3 column（Waters，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液;洗脱程序：0 min：1% B，1 min：1% B，3 min：15% B，6 min：50% B，12 min：95% B，12.1 min：1% B，15 min：1% B;柱温：40℃;自动进样器温度10℃;进样量10 μL;流速0.5 mL/min。Waters Xevo G2XS Q-TOF质谱条件：氮气作为雾化气、锥孔气;氩气作为碰撞气;正负离子模式;主要的参数设置包括：锥孔电压30.0 V;萃取锥孔电压3.5 V;离子源温度120℃;脱溶剂气温度450℃;反向锥孔气流速50.0 L/h;脱溶剂气流速800.0 L/h;离子传输管电压：正离子模式下为3.0 kV，负离子模式下为2.8 kV;Lockspray锁定质量数556.2771（+）、554.2615（-）。

1.7.2 质谱方法  扫描模式MSE、分析模式：灵敏度模式、质荷比范围50～1000 Da、扫描间隔时间0.02 s、数据采集模式：continuum、碰撞能10～50 V。

1.7.3 质量控制方法  在所有待测样本中各取10 μL，混合后作为质量控制样本（Quality control， QC），以便评价分析方法的稳定性和重复性，每8个待测定样本中插入1个QC样本。

1.8 统计学方法

样本品的检测通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱法（Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry， UPLC/Q-TOF-MS）进行。所得样本的总离子流色谱图，在 Progenesis QI软件下，进行峰校准、背景扣除、面积归一化及数据简化处理，并将结果转化为包含化合物保留时间与质荷比信息的csv 格式文件。将上述文件导入EZinfo 2.0软件，通过主成分分析（Principal compoments analysis，PCA）、正交偏最小二乘法—判别分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等统计学分析，得到两组之间的差异代谢物，通过MMCD、HMDB、KEGG数据库和部分标准品进行匹配比较并最终确认潜在生物标志物。数据统计采用SPSS 22.0统计学软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本t检验进行组间比较;计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组的年龄、性别、身高、体重及BMI比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

2.2 微泡的分离与鉴定

采用透射电镜下两组提取的MVs大小均一，外形呈圆形或椭圆形的茶托样结构，可见明显的膜性结构（图1A）。Nanosight Tracking分析表明，纯化的MVs样品的直径范围80～400 nm，平均大小约为（152.4±5.6）nm[SD，（42.9±3.1）nm]，浓度为[（7.70×1010）±（8.74×109）]颗粒/mL（图1B）。Western blot结果显示，血浆来源的微泡表面携带特标识蛋白CD63及TSG101（图1C）。

2.3 两组血浆来源微泡样本的UPLC/Q-TOF-MS总离子流色谱图

正、负离子模式下，血浆来源微泡样本的典型总离子流色谱图（Total ion chromatogram，TIC）。见图2。使用Progenesis QI软件进行峰的提取后，正离子模式下共检测到946个离子，负离子模式下共检测到784个离子。

2.4 两组血浆来源微泡样本的PCA与OPLS-DA分析

将所有样本连同QC样本进行无监督的主成分分析（PCA），以便评价离群值及监测系统的稳定性。在正、负离子模式下的PCA 得分图中两组的样本点在分布上完全分开，组内的聚集效果良好，同时组间的分离趋势显著，提示预测模型的拟合能力较好，同时QC样本在正、负离子模式下的聚集程度良好，表明系统具有良好的稳定性。见图3。

使用有监督的正交最小二乘法判别分析（OPLS-DA）来筛选两组样本的差异代谢物。两组的OPLS-DA 得分图如图4所示，两组的样本点具有良好的分离趋势，其中正离子模式下：R2X=0.566，R2Y=0.953， Q2=0.823;负模式下R2X=0.564，R2Y=0.912，Q2=0.862。结果提示正、负离子模式下模型均良好。

2.5 潜在生物标记物的筛选

筛选出同时满足OPLS-DA的计算变量投影重要度（Variable importance for the projection，VIP）值>1，且独立样本t检验，P<0.05的代谢物，表明该代谢物在两组样本之间具有显著性差异，即潜在的生物标记物。本研究共鉴别出12个差异代谢物。见表2。

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（收稿日期：2021-03-01）

[基金項目] 浙江省自然科学基金项目（LQ17H260005）;浙江省温州市基础性科研项目（Y2020057）