汤 悦 朱 叶 姜璟 王 瑞 沈 桢 郑 珊 陈 功 张崇凡

胆道闭锁(BA)临床表现为新生儿期进行性加重的梗阻性黄疸，随着肝内胆汁淤积的加重，患儿逐渐出现肝纤维化、肝衰竭表现，若未经及时诊治，多数患儿在2岁以内死亡[1]。由于新生儿黄疸病因众多，快速、准确地诊断和治疗BA可改善患儿的预后[2]。

目前新生儿BA筛查手段主要有大便比色卡[3,4]和足跟血片质谱胆红素检测[5]，BA术前诊断方法主要为肝穿刺病理活检和十二指肠引流液，实验室血清标志物为基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)[6,7]。

2016年起复旦大学附属儿科医院(我院)开始制定BA临床实践指南，由我院普外科和临床指南制作和评价中心组成BA临床实践指南工作组，运用GRADE指南制定策略，对BA临床实践指南的6个方面选题(筛查、诊断、肝门空肠吻合术、术后综合管理、术后并发症的治疗、预防接种)中的26个问题进行系统文献检索、筛选和偏倚风险评价，并形成推荐意见。本文针对BA筛查(2项指标)和诊断(4项指标)行系统评价及Meta分析。

1 方法

1.1 文献检索策略 文献检索策略、BA及非BA诊断金标准、文献筛选原则、文献偏倚风险及临床适用性评价方法已由本研究团队2020年8月发表在《基于超声、肝胆核素显像和磁共振胆胰管成像影像学检查诊断BA准确性研究的系统评价和Meta分析》一文中[8]。

提取内容包括：(1)文题；(2)发表年份；(3)国家；(4)研究的纳入和排除标准；(5)研究场所；(6)诊断金标准；(7)待测指标，①大便比色卡：大便比色卡版本、收集时间、随访方式、观察人员、回收率；②足跟血片胆红素：胆红素及其筛查截断值，kasai手术及其月龄；③肝穿刺活检：标本类型、病理医生资质，主要观察指标(6项)：肝内胆管增生、肝门部纤维化、肝外胆管梗阻、胆栓、炎性细胞浸润和胆管板形态；④十二指肠引流液(3项)：引流液颜色、留置位置、是否同位素显像及强度；⑤MMP-7：患儿特征、检测标本类型、诊断试剂盒种类、诊断截断值；⑥GGT：检测时间、试剂盒。提取诊断四格表的数据。

1.3 文献偏倚风险和临床适用性评价 采用QUADAS-2评价工具，从4 个领域的11个条目对纳入文献按” 是”、“否”、“不确定”进行评价。4个领域中≥3个低风险(LR)和高风险(HR) 分别为高质量和低质量，2个LR和≥1个HR为低质量，2个LR和2个不确定(UR) 为中等质量，1个LR+3个UR或4个UR 为低质量。偏倚风险由姜璟、汤悦和朱叶分别评价，由BA临床实践指南工作组审核。

1.4 统计学分析 采用STATA 14及Revman 5.3软件进行统计分析。对合并后数据采用合并受试者工作特征(SROC)曲线分析，计算曲线下面积(AUC)、合并后的敏感度、特异度，所有结果均用95%CI表示。异质性检验采用I2检验，I2>50%认为异质性较大。发表偏倚分析采用Deeks法。

2 结果

2.1 文献检索结果 中、英文数据库共检索到15 435篇文献，中文2 020篇，英文13 425篇。根据BA临床实践指南文献筛选过程，最终纳入308篇文献。图1显示，新生儿BA筛查：大便比色卡和足跟血片质谱胆红素筛查分别有5篇和1篇文献进入本文Meta分析；新生儿BA术前诊断：肝穿刺活检和十二指引流液分别为10篇和8篇文献进入本文Meta分析；实验室血清标志物MMP-7和GGT分别为4篇和14篇文献进入本文Meta分析。

图1 文献筛选流程图

2.2 纳入文献一般特征

2.2.1 大便比色卡 表1显示，5篇文献发表于2006至2018年；中国3篇(台湾2篇，大陆1篇)，日本和加拿大各1篇；比色卡不同国家版本不同，中国台湾2项研究大便比色卡版本较为一致；中国台湾、日本和加拿大均在1月龄体检时收集比色卡，中国大陆于生后14 d、30 d、42 d和4个月时体检时收集大便比色卡；均由新生儿照护者行粪便与大便比色卡对比；中国台湾1项研究回收率65.2%，1项研究未报告，中国大陆研究回收率92.5%，日本研究回收率84.3%，加拿大研究未报告回收率，金标准诊断BA 146(6～75)例、非BA 93 0750(87 582～421 994)例。

表1 大便比色卡文献特征

2.2.2 足跟血片质谱胆红素 2020年美国1项多中心的前瞻性基于普查政策的诊断准确性研究，纳入出生于美国德克萨斯州14家医院的124 385例新生儿，所有新生儿均行足跟血片质谱胆红素筛查BA，筛查阳性新生儿再行金标准诊断[5]。该研究同时进行了1项自身前后对照试验，比较了在2015年开展足跟血片质谱胆红素筛查试验前后行Kasai手术日龄。

2.2.3 肝穿刺活检 表2显示，8篇文献发表于1993至2016年，亚洲国家5篇(中国大陆及台湾地区2篇，伊朗2篇，韩国1篇)，欧洲国家1篇(塞尔维亚)，美洲国家1篇(美国)；经皮肝穿刺8篇，其中1篇同时包括手术楔形标本穿刺；4篇文献没有报告病理科医生资质；肝穿刺6项主要观察指标无1篇文献全部报告；金标准诊断BA 388(19～136)例、非BA 375(18～91)例。

2.2.4 十二指肠引流液 表3显示，7篇文献发表于1990至2018年。亚洲国家共5篇(中国大陆及台湾4篇，日本1篇)，欧洲国家1篇(塞尔维亚)，美洲国家1篇(墨西哥)。无1篇文献对本文3项十二指肠引流液主要观察指标全部报告，2篇以颜色+同位素判断，4篇以颜色判断，1篇以颜色+胆红素含量判断；留置位置：2篇在十二指肠二段，3篇在十二指肠三段，2篇幽门后30 cm,1篇仅描述在十二指肠； 判断时间4～72 h；金标准诊断BA 470(16～174)例、非BA 625(21～222)例。

表2 肝穿刺文献特征

表3 十二指肠引流液文献特征

2.2.5 MMP-7 表4显示，4篇文献发表于2017至2019年；中国3篇，美国1篇；美国检测人群为确诊的BA匹配新生儿肝炎，中国为新生儿至生后150 d黄疸婴儿；中国2个研究试剂盒为云克隆，诊断截断值(ng·mL-1)分别为52.8和10.4，另1个研究试剂盒为R&D，诊断截断值为1.4 ng·mL-1，美国试剂盒为Millplex，未报告诊断截断值；1篇文献报告了标本采集于首次就诊时，余均未报告；金标准诊断BA 330(35～187)例、非BA 260(35～101)例。

表4 血清MMP-7文献特征

2.2.6 GGT 表5显示，15篇文献发表于1985至2019年；亚洲国家报告11篇(中国7篇，日本、韩国、伊朗、土耳其各1篇)，美洲3篇(美国、加拿大、墨西哥各1篇)，非洲1篇(埃及)；8篇文献GGT截断值≥300 IU·L-1；7篇文献GGT截断值<300 IU·L-1；1篇文献报告(GGT)用Jacob法，1篇文献报告用Flex试剂盒；金标准诊断BA 1 331(12～590)例、非BA 903(12～191)例。

表5 GGT文献特征

2.3 文献偏倚风险评价 图2显示，大便比色卡：2篇低风险，3篇中等风险；肝穿刺活检：高和低风险各5篇；十二指肠引流液：4篇低风险，1篇中等风险，2篇高风险；MMP-7：3篇低风险，1篇中风险；GGT：低和中等风险各6篇，2篇高风险。足跟血片质谱胆红素文献无偏倚风险。

2.4 文献适用性评价 图2显示，大便比色卡：病例选择维度3篇高适用性，2篇不确定；待测标准维度均为高适用性；金标准维度均为不确定。肝穿刺活检：病例选择维度7篇高适用性，3篇低适用性；待测标准维度5篇高适用性，2篇不确定，3篇低适用性；金标准维度6篇高适用性，1篇不确定，3篇低适用性。十二指肠引流液：病例选择维度2篇高适用性，3篇不确定，2篇低适用性；待测标准维度4篇高适用性，3篇不确定；金标准维度4篇高适用性，3篇不确定。MMP-7：病例选择维度均为高适用性，待测标准维度均不确定，金标准均为高适用性。GGT: 病例选择维度8篇高适用性，2篇不确定，4篇低适用性；待测标准维度13篇高适用性，1篇不确定；金标准维度2篇高适用性，11篇不确定，1篇低适用性。

图2 文献偏倚风险和临床适用性评价

2.5 Meta分析结果

2.5.1 大便比色卡筛查BA 共纳入5项研究，图3显示，敏感度84%(95%CI：76%～90%)，I2=0；特异度100%(95%CI：100%～100%)，I2为86.4%；AUC为0.99(95%CI：0.98～1.00)。

2.5.2 足跟血片质谱胆红素筛查BA 出生于美国德克萨斯州14家医院的124 385例新生儿，所有新生儿均行足跟血片胆红素和金标准筛查BA。金标准：随访(在德克萨斯州有3家儿童肝病中心集中收治BA病例)和必要时的手术探查。接受2个阶段的不同胆红素截断值的筛查；第1阶段：生后60 h内的胆红素水平，若大于不同中心正常值范围的P95即为阳性(因不同中心胆红素检测仪器不同)；第2阶段：第1阶段测定阳性的新生儿2周内复测胆红素水平，较第1阶段胆红素值升高或胆红素值>10 mg·L-1即为阳性。2个阶段的胆红素筛查敏感度为 100% (95%CI：56.1%～100%),特异度为99.9% (95%CI：99.9%～99.9%),阳性预测值为 5.9% (95%CI：2.6%～12.2%), 阴性预测值为100% (95%CI：100%～100%)。

图3 大便比色卡筛查BA敏感性和特异性Meta分析

纳入德克萨斯州3家儿童肝病中心2015年前未开展足跟血片质谱胆红素筛查时经手术确诊并接受Kasai手术的BA患儿24例。2015年后开展足跟血片质谱胆红素筛查试验后经手术确诊并接受Kasai手术的BA患儿19例(6例于合作医院出生经筛查后进一步明确诊断，7例为非合作医院出生但经足跟血片质谱胆红素筛查后诊断，6例因出现相关症状转诊后诊断)，开展筛查前平均手术日龄为(56±19)d，开展后平均手术日龄为(36±22)d，两者差值为19 d(95%CI：7～32 d，P=0.004)。

2.5.3 肝穿刺活检诊断BA 共纳入8项研究，图4显示，敏感度96% (95%CI：92%～98%)，I2=64.2%；特异度96%(95%CI：92%～97%)，I2=13.4%；AUC为0.98(95%CI：0.96～0.99)。

图4 肝穿刺活检诊断BA敏感性和特异性Meta分析

2.5.4 十二指肠引流液诊断BA 共纳入7项研究，图5显示，敏感度96%(95%CI： 92%～96%)，I2=34. 8%；特异度86%(95%CI：79%～91%)，I2=80.2%；AUC为0.97(95%CI：0.96～0.98)。

图5 MMP-7诊断BA敏感性和特异性Meta分析

2.5.5 MMP-7诊断BA 共纳入4项研究，图6显示，敏感度96%(95%CI：93%～98%)，I2=0%；特异度91%(95%CI：85%～95%)，I2=56.7%；AUC为0.97(95%CI：0.95～0.98)。

图6 十二指肠引流液诊断BA敏感性和特异性Meta分析

2.5.6 GGT诊断BA 纳入15项研究，图7显示，敏感度81%(95%CI：71%～88%)，I2=87.1%；特异度79%(95%CI：72%～85%)，I2=72.3%；AUC为0.87(95%CI：0.83～0.86)；Deeks发表偏倚检验P=0.40，提示发表偏倚较小。

图7 GGT诊断BA敏感性和特异性Meta分析

3 讨论

大便比色卡筛查项目最早由1987年在日本发起[39]，已经在中国台湾、日本、加拿大等广泛应用[3,10,12,40]，在中国大陆也得到了一定推广[11]。本文针对大便比色卡目前的临床应用，对已发表的文献进行系统综述及Meta分析，结果提示大便比色卡具有良好的特异度(100%，95%CI：100%～100%)，敏感度(84%，95%CI：76%～90%)尚不够理想。大便比色卡成本低[41]，是目前以为理想的筛查手段，然而，对一种广泛应用的筛查方式而言，大便比色卡仍有诸多改良空间，其诊断的准确性依赖于患儿父母的依从性、医护人员的认识程度以及比色卡的设计等环节。利用手机APP、小程序等多元化的大便比色卡模式也正逐渐兴起。大便比色卡随着简便、成本低廉的筛查方式仍不断出现，会得到更进一步的推广。

近年来，通过新生儿足跟血质谱检测胆红素水平对BA进行早期筛查正逐渐受到各中心的重视，有研究发现通过该方法可以在生后60～96 h发现潜在的BA患儿[42]。本研究纳入的1篇文献提示采用足跟血片质谱筛查BA敏感度100.0%(95%CI：56.1%～100.0%)，特异度99.9%(95%CI：99.9%～99.9%)。其敏感度置信区间较大，提示本研究研究结果尚不稳健，可能由于该疾病患病率低、样本量仍较小有关，尽管该研究具有较好的临床应用前景与价值，目前需要多中心、大范围的临床研究进一步证实该结果。

肝穿刺活检在诊断新生儿梗阻性黄疸中有着不可替代的作用，并在一些国家作为诊疗常规进行使用。本文Meta分析结果显示，肝穿刺活检对BA进行诊断，合并后敏感度96% (95%CI：91%～98%)，特异度96%(95%CI：92%～97%)，拟合SROC曲线后AUC为0.98(95%CI：0.97～0.99)，具有很高的诊断价值。目前也有学者对病理标准化诊断工具进行了深入探索，期望进一步提高肝穿刺活检诊断的准确性。然而，肝穿刺活检作为创伤性检查，具有一定风险，且病理诊断依赖于病理科医生的水平，部分患儿需反复穿刺。

MMP-7作为一种肝星形细胞分泌的蛋白酶，在以往的研究中被认为是一种与BA患儿肝脏纤维化相关的血清标志物，并在实验中证实与胆管上皮损伤有关[25]。相较GGT，MMP-7诊断BA的灵敏度、特异度更高[7]。本文Meta分析纳入文献质量好，临床应用风险小，具有良好的诊断效用。然而，目前对于诊断BA的截断值尚未统一(1.43～52.85 ng·mL-1)，且纳入的人群、接受检测时的年龄、采血的方式、采用的试剂盒的品种等因素存在差异，因此针对MMP-7的临床应用仍需要更大规模的研究。

十二指肠引流液在部分中心作为常规诊断手段，本文Meta分析将肉眼观察十二指肠引流液颜色作为观察指标合并后敏感度96%(95%CI： 92%～96%)，特异度86%(95%CI：79%～91%)，具有一定的诊断价值。部分研究为了提高十二指肠引流液诊断准确性对该方法进行了改进，如对引流液进行胆汁酸检测、采用同位素等方式，报道可提高诊断灵敏度，然而结果较为分散。在临床上，十二指肠引流液检查由于观察引流液所耗费时间较长(通常24～48 h)，会人为延长BA患儿的诊断过程；此外，由于在放置、观察十二指肠引流管的过程中，患儿需经历插胃管至十二指肠、禁食等，部分患儿难以耐受，因而对于十二指肠引流液在BA诊疗过程中的地位需要更深入的探讨。

对于临床考虑新生儿梗阻性黄疸患儿，血清学检查是必不可少的环节，以往研究认为高GGT血症与BA存在联系，本文Meta分析纳入的15篇文献合并后，提示GGT诊断BA的敏感度为81%(95%CI：73%～88%)，特异度79%(95%CI：72%～84%)。以不同的截断值作为亚组进行分析，发现截断值改变对曲线下面积并无明显影响。尽管GGT在临床有着广泛应用，单纯以患儿GGT的水平对BA进行诊断存在一定局限性，其敏感度与特异度较其他常用诊断方法并不理想，但作为最基本的检查方法，仍有一定参考价值。

作为BA的筛查项目和术前诊断项目，除MMP-7外，各项目均提示异质性明显。大便比色卡研究中，不同比色卡的设计形式、回收时间等可能会对阳性与阴性的判别造成影响；GGT、MMP-7的研究中，接受检测的人群、检测时的年龄、采血的方式、检测试剂、检测方法不同，均可导致结果存在差异；十二指肠引流液不同研究对阳性结果的判别方法(肉眼判断或检测引流液中标志物的水平)存在较大差异，从而引入了异质性；肝穿刺活检中，活检的方法、病理科医生的主观判断对结果的影响较大。此外，研究中纳入的BA和非BA的比例存在差异，尤其是大便比色卡筛查，纳入的人群较大，放大了大便比色卡的诊断特异性，在合并结果时会导致偏倚。

综上所述，鉴于大便比色卡的筛查的无创性、便捷性和经济性，新生儿期采用大便比色卡行BA筛查有较好的筛查效应。新生儿足跟血片质谱胆红素筛查胆道闭锁仍需更大范围的临床研究；血清学标志物MMP-7、肝穿刺活检及十二指肠引流液检查均具有诊断价值，但MMP-7检测方法较为精准快捷；GGT诊断BA的价值有限，其截断值仍需进一步探究。