李 涵

（濮阳职业技术学院，河南濮阳 457000）

大气中包括甲烷在内的温室气体浓度增加会导致全球变暖，这是近年来人们关注的主要问题。近年，畜牧业中反刍动物排放的甲烷引起重视。甲烷是一种比二氧化碳强23倍的温室气体，反刍动物肠道发酵产生的甲烷主要是由于兼性厌氧条件对细菌、原生动物和真菌的生长有利（孙福昱等，2018）。瘤胃内的甲烷排放被认为是一个能量浪费过程（Johnson等，1995）。许多化学食品添加剂已经被证明具有减降低瘤胃甲烷排放的潜力，但它们要么对宿主动物有毒，要么对有益的瘤胃微生物产生副作用。为降低反刍动物甲烷排放，选择具有生物活性的化合物来降低原生动物活性已成为一种研究方法。但在供人类食用的动物身上使用化学物质的风险越来越受到公众关注。Kim等（2012）研究表明，植物提取物可以控制瘤胃微生物多样性，是降低甲烷排放的较好替代选择，这种方法也是动物营养学家认为最有潜力的策略。本研究旨在评估松树和银杏叶提取物对瘤胃发酵、瘤胃产甲烷和产甲烷相关微生物的体外作用。

1 材料与方法

1.1 试验原料与体外发酵 以100 g/300 mL的溶剂，用70%的乙醇制备松树和银杏叶提取物。将含70%乙醇的烧瓶塞住，在39℃的旋转蒸发仪上孵育24 h。从压碎的叶子中提取松树和银杏叶汁液，然后用滤纸过滤，收集滤液，用旋转蒸发器将70%乙醇溶剂除去，4℃保存备用。从5头500 kg重、带有瘤胃瘘管荷斯坦奶牛瘤胃中收集瘤胃液，瘤胃液经四层纱布过滤后分为5组，对照组不添加植物提取物，T1组添加5%松树液，T2组添加5%松树70%乙醇提取物，T3组添加5%银杏叶液，T4组添加5%银杏叶70%乙醇提取物。将瘤胃液注入血清瓶，置于39℃的振荡培养箱中培养24 h。体外试验每组3个重复。孵育后分别测定瘤胃液pH、挥发性脂肪酸总量、乙酸、丙酸和丁酸含量。参考王荣等（2019）的研究方法测定瘤胃发酵气体生成总量、甲烷和二氧化碳量。

1.2 微生物定量 从培养液中取30 mL样品，用宽口径的移液管取1.0 mL的溶液，以确保样品中含有液体和消化液，用核酸提取试剂盒提取RNA。参考Ohene-Adjei等（2008）的方法设计纤毛虫、产甲烷菌和产琥铂酸丝状杆菌的引物，并进行实时荧光定量PCR分析，测定结果以对照组进行归一化，处理组表示为相对于对照组的相对表达量。

1.3 统计分析 数据分析采用SAS统计分析软件的一般线性模型，利用Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 植物提取物对瘤胃体外发酵特征的影响由表1可知，松树和银杏叶提取物显著影响瘤胃体外发酵总气体产量、甲烷排放和二氧化碳排放量（P＜0.05），其中松树和银杏叶乙醇提取物较对照组显著降低了气体总量和甲烷排放量（P＜0.05），而5%松树液和5%银杏叶乙醇提取物较对照组瘤胃体外发酵二氧化碳产量显著降低了31.17%和33.02%（P＜0.05）。

由表2可知，银杏叶液和银杏叶乙醇提取物组瘤胃pH较对照组显著提高了0.94%和0.79%（P＜0.05），而对照组挥发性脂肪酸总量最高，较处理组分别显著提高10.39%、11.12%、8.58%和9.62%（P＜0.05），处理组间对挥发性脂肪酸总量的影响无显著差异（P＞0.05）。此外，对照组乙酸、丙酸和丁酸含量也表现最高，其中乙酸含量较T1、T2和T4组分别显著提高9.15%、10.30%和9.80%（P＜0.05），丙酸含量较T1和T2组分别显著提高11.69%和12.62%（P＜0.05），丁酸含量较处理组分别显著提高12.28%、13.52%、10.36%和10.44%（P＜0.05）。T1组乙酸与丙酸比值最高，分别较对照组、T3和T4组显著提高2.55%、1.52% 和 3.08%（P＜ 0.05）。

2.2 植物提取物对瘤胃体外发酵微生物相对表达量的影响 由表3可知，与对照组相比，处理组瘤胃体外发酵中纤毛虫、产甲烷菌和产琥铂酸丝状杆菌的相对表达量降低了25%～49%（P＜ 0.05）。

3 讨论

体外瘤胃发酵可能受植物提取物的用量和提取溶剂的影响，如Pfister等（1992）指出，牛饲料中添加15%～30%的松树叶似乎是瘤胃发酵毒性作用的阈值。但植物提取物对牛消化性能的不良影响还有待进一步研究。在本研究中，松树和银杏叶乙醇提取物较对照组显著降低了气体总量和甲烷排放量。银杏叶提取物对pH的影响也显著，同时各植物提取物的挥发性脂肪酸总量均显著低于对照组，这表明氢气产物可能被用作瘤胃产甲烷菌转移甲烷的底物。因此，氢气对反刍动物的微生物生态系统具有重要意义。此外，由琥珀酸形成丙酸会导致氢气的产甲烷能力降低。肠内发酵产生的氢气是反刍动物甲烷生成的前体，调控氢气而非甲烷是控制反刍动物甲烷排放的关键。本研究结果表明，植物提取物特别是银杏叶乙醇提取物可能影响甲烷生成，降低瘤胃甲烷排放。

表1 植物提取物对瘤胃体外发酵气体生成的影响 mL/g

表2 植物提取物对瘤胃体外发酵特性的影响

表3 植物提取物对瘤胃体外发酵微生物相对表达量的影响

本试验使用的松树和银杏叶提取物具有驱虫剂、抗菌和抗氧化活性，并已被用作药物用途（Lee等，2006）。松树和银杏叶中的次生化合物（如黄酮类化合物）可能调控瘤胃发酵，抑制瘤胃内的微生物，尤其是原生动物。特别是银杏叶提取物具有天然的杀虫作用，可能还具有驱虫剂和抗菌作用。Yoo等（2004）在离体试验模型中对松树叶提取物的抗氧化活性进行了研究，发现松树提取物中总多酚类化合物的含量为1.61%。本研究通过实时荧光定量PCR分析了体外瘤胃发酵液中微生物的表达量。一些瘤胃纤毛虫和产甲烷菌被认为是共生体，本研究结果表明，补充松树和银杏叶提取物可降低纤毛虫数量，抑制甲烷生成，进而降低瘤胃甲烷排放。Broudiscou等（2000）筛选了植物提取物，对其产甲烷作用、发酵模式和原生动物数量进行了评估，结果发现，植物提取物对产甲烷有轻微的抑制作用。Jo等（1997）在体研究了牧草（紫花苜蓿、金合欢叶和松树叶）对韩国山羊采食量和消化率的影响，体内研究结果表明，松树叶组的干物质摄入量和干物质消化率均低于其他饲料，但本试验体外研究结果未显示添加植物提取物对产琥珀酸丝状杆菌基因表达有不利影响。

4 结论

植物提取物（松树和银杏叶乙醇提取物）降低了瘤胃体外发酵甲烷产量，但有必要进一步探讨植物提取物的剂量和植物提取物是否对瘤胃具有副作用。