朱洁茹，欧建平△，李 涛，朱伟杰

（1中山大学附属第三医院生殖医学中心，广东广州 510630；2暨南大学生命科学技术学院，广东广州 510632）

当卵泡的窦腔形成后，颗粒细胞分化成两种细胞亚群，分别为围绕卵泡壁的壁层颗粒细胞（mural granulosa cells，MGCs）和附着于卵母细胞的卵丘细胞（cumuluscells，CCs）［1］。MGCs 含有多种激素受体，以自分泌和旁分泌的形式调控卵泡发育、成熟与甾体激素合成［2］，常用作研究卵巢功能的细胞体外模型。目前人MGCs 主要从取卵术废弃的卵泡液中获取［3］，来源易得，但从卵泡液中分离MGCs 需要多次离心等处理，且卵泡液中的MGCs混杂较多红细胞和其它杂质，干扰因素多。因此，应充分阐明MGCs的细胞体外状态，建立合适卵巢功能研究的细胞模型。

CCs是围绕着卵母细胞生长的颗粒细胞层，与卵母细胞形成一个相辅相成的“合胞体”，为卵母细胞提供营养，调节减数分裂的恢复，影响精卵结合和早期胚胎发育［4］。在取卵术中，卵丘卵母细胞复合物被抽吸出来，随后按体外受精（in vitro fertilization，IVF）或单精子卵胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的需要，一部分CCs 被切割而丢弃。这部分CCs 的获取过程简单，且没有过多的其它杂质，红细胞污染少，从理论上而言，CCs是研究卵巢功能的合适细胞体外模型。但对CCs 细胞模型的实验方法学，以及与MGCs 细胞模型的比较仍需充分评价。

自噬和凋亡是细胞在应对环境变化时的两种方式［5-6］，可以反映细胞的活性状态。本项工作比较人MGCs 与CCs 体外分离及原代培养的效果，并检测自噬和凋亡相关基因的表达来分析分离后的细胞特性，以期为深入认识MGCs 与CCs 的细胞体外状态、建立卵巢功能研究的细胞模型提供参考资料。

材料和方法

1 颗粒细胞来源

选取16 例于中山大学附属第三医院生殖医学中心行IVF/ICSI患者取卵日的卵泡液及其卵丘-卵母细胞复合物（223 个），所收集标本均为医疗废物，由常规治疗过程产生，标本获取不影响患者的治疗。所有患者均签署知情同意书，本研究经中山大学附属第三医院伦理委员会批准。患者年龄24～43 岁，无合并全身重大脏器疾病或慢性内科疾病。

2 主要试剂

0.25 %胰酶、DMEM/F12 培养液和胎牛血清（fe⁃tal bovine serum，FBS）购自Gibco；淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque PREMIUM）购自Pharmacia；台盼蓝和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）购自北京索莱宝公司；卵泡刺激素受体（follicle-stimulat⁃ing hormone receptor，FSHR）流式抗体购自R&D Sys⁃tems；红细胞裂解液购自BD；高纯总RNA 快速提取试剂盒（离心柱型）、逆转录试剂盒和PCR 试剂购自TaKaRa；RIPA 裂解缓冲液购自上海碧云天生物技术研究所；脱脂奶粉购自Difco；GAPDH 抗体、微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗体、P62 抗体、Bax 抗体、Ⅱ抗羊抗兔IgG购自Proteintech。

3 方法

3.1 MGCs和CCs的分离

3.1.1 MGCs 的分离 收集拾卵后弃去的卵泡液，200×g离心10 min 后弃上清，PBS 重悬，并加入等体积的0.25%胰酶，室温消化15 min 后用含10% FBS的DMEM/F12培养液终止消化，200×g离心10 min后弃上清，PBS 重悬，然后缓慢地小心地将悬液转移到等量的Ficoll分离液液面上，400×g离心20 min，若此时液体未出现明显分层，可适当加大离心力或延长离心时间。至分层明显后，将中间颗粒细胞层小心吸出，用含10% FBS 的培养液洗涤1 次后重悬待计数。

3.1.2 CCs 的分离 拾卵时吸出卵丘-卵母细胞复合物后，在MOPS 缓冲液中用1 mL 注射器机械切割挑出卵子周边的卵丘颗粒细胞团，并用IVF 液冲洗，随后转移至无菌离心管中，加入1～2 mL 0.25%胰酶，室温下消化并反复吹打，3～5 min 后用含10%FBS 的DMEM/F12 培养液终止消化，PBS 洗涤1 次，离心后重悬待计数。

3.2 细胞计数与存活率检测 称量4 g 台盼蓝粉末，加入100 mL纯水溶解，过滤后取滤液，即配成4%台盼蓝母液；使用时将台盼蓝母液与PBS 缓冲液以1∶9 的比例配成0.4%工作液。将MGCs 和CCs 细胞悬液稀释成（1～10）×105/L 的密度，吸取100 μL 至EP管中，以1∶1 的比例与0.4%台盼蓝工作液混合，静置3 min 后吸取10 μL 至血球计数板中，进行细胞计数和存活率检测。

3.3 细胞原代培养、细胞爬片与HE染色 将MGCs和CCs 细胞悬液接种至6 孔板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，（24～48）h 换液1 次，第1 次为半量换液，以后为全量换液。培养后48 h 于显微镜下观察细胞贴壁和生长状态并拍照。继续培养至对数生长期，留作后续qPCR和Western blot实验。

另将部分MGCs 和CCs 分别接种至预先放有防脱载玻片的24孔板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，（24～48）h 换液1 次，第1 次为半量换液，以后为全量换液。当细胞爬满载玻片的70%时取出载玻片进行HE染色。

3.4 细胞纯度鉴定 采用流式细胞术检测FSHR的表达以进行细胞纯度鉴定。两种细胞每106个细胞孵育10 μL FSHR 流式抗体，涡旋震荡，室温避光孵育30 min，随后300×g离心5 min，弃上清后加入2 mL PBS 重悬，洗涤1 次。再加入2 mL 红细胞裂解液，室温避光孵育10 min，洗涤2 次。然后加入200～400 μL PBS，重悬于FACS 流式管中，置于流式细胞仪上检测。实验重复3次。

3.5 LC3、P62 和Bax mRNA 的qPCR 检测 收集对数生长期的MGCs和CCs，根据高纯总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）使用说明抽提总RNA，根据逆转录试剂盒步骤进行逆转录反应，依次在PCR 反应管中加入20 反应体系，包括ddH20 7.4 μL，SYBR 10 μL，逆转录产物1 μL，引物1.6 μL，于PCR 仪上反应，反应条件为：94℃10 s，60℃15 s，72℃12 s，总共40个循环。所有样本均按3个复孔加样。引物序列见表1。

3.6 LC3、P62 和Bax 蛋白的Western blot 检测 每个样品根据细胞数量分别加入20～50 μL 含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RI⁃PA 裂解缓冲液，用BCA 法检测蛋白浓度。每孔上样量20 μg，在15%（LC3）或12%（P62、Bax）SDSPAGE 中分离，随后转移到聚偏二氟乙烯（polyvinyli⁃dene fluoride，PVDF）膜上（LC3 采用0.22 μm PVDF膜，P62、Bax采用0.45 μm PVDF膜）。将PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温浸泡1 h，置于含有内参抗体、目的抗体的盒子中4℃孵育过夜（抗体稀释比例如 下：LC3 为1∶500，P62 为1∶1 000，Bax 为1∶1 000，GAPDH 为1∶1 000）。用1×TBST 洗涤后，将膜与Ⅱ抗（稀释1∶50 000）室温下放置1 h，1×TBST洗膜3次，超敏发光液曝光显色及拍照。

表1 qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for qPCR

4 统计学处理

细胞分离与培养实验重复3 次。qPCR 数据用LightCycler 480 软件进行分析，采用相对定量法比较2−ΔΔCt的值；Western blot应用ImageJ 1.48图像处理软件进行灰度分析。使用SPSS 20.0进行统计学分析，结果用均数±标准差（mean±SD）表示，采用两独立样本t检验进行均数间比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 MGCs和CCs的分离耗时、细胞总数及存活率

CCs 的分离耗时少于MGCs，分离结束时的存活率高于MGCs，但细胞总数少于MGCs（P＜0.05）。见表2。

表2 MGCs和CCs的分离情况比较Table 2.The comparison of isolation parameters between MGCs and CCs（Mean±SD.n=16）

2 MGCs和CCs的细胞纯度

使用流式细胞术检测FSHR 的表达进行细胞纯度鉴定，分离后CCs 与MGCs 的FSHR 表达量分别为（92.23±2.66）%和（81.33±6.57）%，差异具有显著性（P＜0.05）。流式细胞术分析图见图1。

3 MGCs和CCs体外原代培养的生长状态

HE 染色可见MGCs 和CCs 生长状态良好，细胞形态呈类成纤维细胞状，细胞伪足延展，相互连接；细胞核蓝染，圆形，核仁明显；胞质透亮呈淡红色，可见丰富的黑色颗粒分布，见图2。培养48 h 后，光镜下可见细胞单层贴壁生长，呈梭形或星形，伪足呈丝状突起，CCs 比MGCs 的细胞外观更纯净，细胞体积更大，伸展状态更佳，见图2。

Figure 1.FSHR expression of MGCs and CCs after isolation.图1 分离后MGCs和CCs的FSHR表达量

4 LC3、P62、Bax在MGCs与CCs中的mRNA表达水平

CCs 的LC3 mRNA 表达水平显著低于MGCs（P＜0.01），Bax 的mRNA 表达水平显著高于MGCs（P＜0.05），CCs 与MGCs 的P62 mRNA 表达水平比较，没有显著差异（P＞0.05）。见图3。

5 LC3、P62 和Bax 蛋白在MGCs 与CCs 中的表达水平

CCs 的LC3-Ⅱ/Ⅰ水平显著低于MGCs（P＜0.01），Bax 蛋白表达水平显著高于MGCs（P＜0.05），CCs 与MGCs 的P62 蛋白表达水平比较，没有显著差异（P＞0.05）。见图4。

Figure 2.The growth status of MGCs and CCs primary cultured in vitro.HE diagrams of cells climbing 70% of glass slide and light micrograph of cells after primary culture for 48 h were showed（scale bar=200 μm）.图2 MGCs和CCs体外原代培养的生长状态

Figure 3.The relative mRNA expression of LC3，P62 and Bax in MGCs and CCs.Mean±SD.n=16. *P＜0.05，**P＜0.01 vs MGCs.图3 MGCs和CCs的LC3，P62，Bax mRNA表达水平

Figure 4.The protein expressions of LC3，P62 and Bax in MGCs and CCs.Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs MGCs group.图4 MGCs和CCs的LC3、P62和Bax蛋白表达水平

讨 论

颗粒细胞是卵泡中最大的功能细胞群，它以自分泌和旁分泌参与卵母细胞发育、成熟［7］，与卵母细胞生殖生理有着密切联系。MGCs 和CCs 是颗粒细胞的两个亚群，借助于MGCs和CCs的研究可以增进卵巢功能内分泌调控的认识。故此，有必要对MGCs和CCs的细胞模型进行充分评价。

以往实验评价了多种人卵巢MGCs 的分离和提纯方法，包括密度梯度离心法、裂解法和沉淀法等，但都不可避免出现分离耗时长、细胞纯度低等问题［8］，直接影响了细胞体外状态及模型的效果。在本实验，我们采用机械切割法+酶解法分离CCs，分离耗时显著少于密度梯度离心法分离MGCs。成熟卵子周围的卵丘细胞团主要成分是CCs 和透明质酸等细胞外基质，故此，分离CCs 只需要把卵丘细胞团从卵丘-卵母复合物中切割出来，用胰酶或透明质酸酶把透明质酸消化即可，操作简单，因而耗时少。而密度梯度离心法利用淋巴细胞分离液离心后形成不同的密度梯度，卵泡液中的各种细胞成分根据密度不同分布在离心管内不同层面，从而实现细胞的分离纯化［9-10］。由于分离MGCs 需收集卵泡液，卵泡液量多，要作多个离心管分装进行分离，且加在分离液层上的卵泡液一般约3 mL，否则会影响细胞的沉降速度［11］；加上该分离方法需要多次离心，整个操作过程较为繁琐，故分离MGCs耗时较长。

FSHR 特异性表达于颗粒细胞，可用于鉴定颗粒细胞的纯度［12］。在本研究中，应用流式细胞术比较分离后CCs 与MGCs 的FSHR 的表达，结果显示CCs细胞纯度高于MGCs。由于卵泡液成分复杂，含有大量红细胞、少量白细胞和其他成分［13］，难以通过离心完全弃去杂质，导致分离后MGCs仍混有其他细胞成分，使细胞纯度降低。此外，密度梯度离心法分离MGCs 需要时间长于CCs 分离法，且MGCs 须经历多次离心洗涤程序，离心力会对细胞造成损伤［14］，上述因素可能导致MGCs存活率显著低于机械切割法+酶解法分离CCs，这是应用MGCs 模型须注意的问题；另一方面，相对于从卵泡液可收集到MGCs，CCs 是显微镜下对卵丘-卵母细胞复合物作切割获得，切割出来的CCs 包裹着大量的黏液团，其为细胞外基质成分。为避免黏液团的黏性限制CCs 在体外生长［11］，本实验采用胰酶消化。由图2 可见，消化了黏液团后的CCs比MGCs生长的体积更为饱满，伪足伸展性更佳，贴壁更好。MGCs在分离时难分散成单个细胞，培养时细胞容易成团块状生长，限制了其延展，且分离的MGCs 不可避免混有红细胞，红细胞沉降在培养皿底部，影响了细胞的贴壁。因此，在体外培养，CCs比MGCs显示出更好的细胞延展性。

CCs 和MGCs 需经历分离、纯化等一系列人为操作才作为细胞模型用于实验。为了解体外处理后的细胞状态，除了细胞存活率，本研究采用了自噬和凋亡基因的表达变化来进一步了解细胞特性。LC3 是自噬延伸阶段的重要泛素化蛋白，其数量和自噬体的数量呈正相关，是分析自噬强弱的指标［15］；选择性接头蛋白P62可用于评估自噬流的通畅程度［16］；Bax是B 细胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）家族中的促凋亡蛋白，通常认为它的激活是导致凋亡发生的重要事件［17］。结果表明，CCs 与MGCs 的P62 mRNA 和蛋白表达水平没有显著差异，提示两种细胞的自噬流通畅程度相似；CCs 中LC3 mRNA 和LC3-II/I 的水平显著低于MGCs，而Bax mRNA 和蛋白的表达水平显著高于MGCs，提示在体外培养下，CCs 可能比MGCs 有较低的自噬活性和较高的凋亡活性，这种情况或许与CCs 脱离了卵母细胞有关。在体内，CCs围绕卵母细胞生长，卵丘-卵母复合物形成独特的微环境，CCs的生理功能受卵母细胞分泌因子的调控，卵母细胞分泌因子可保护CCs免于凋亡［18］，而CCs 脱离了卵母细胞，失去了卵母细胞分泌因子的调控，有可能使细胞的凋亡活性升高。

综上所述，CCs 比MGCs 分离提纯更高效。机械切割法+酶解法分离CCs 方法简便，收集细胞的纯度高，细胞状态良好，可用于原代培养实验。如需长期体外培养，单独的CCs 可能容易发生凋亡，或需加入卵母细胞分泌因子等模拟CCs 在体内的微环境，以提高CCs体外培养的稳定性。