郭 琴，骆 婕，廖凤儿，陶 莹

（广东药科大学附属第一医院/临床医学院妇产科，广东广州 510080）

据统计，每7 对夫妇中就有1 对发生不孕，且这些不孕病例中有很大一部分病因直接或间接与女性肥胖有关［1］。育龄期肥胖的女性经常会出现月经周期紊乱、排卵障碍、流产风险增加和妊娠时间延迟等生殖功能障碍类疾病［1-2］。另外，育龄期肥胖还是多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）发病的重要因素之一［3］。约30%～50%的育龄期肥胖女性是PCOS患者，而PCOS患者中肥胖女性占据50%～70%［4］。因此，不管是否PCOS，育龄期肥胖均可导致女性生殖功能障碍，但其中涉及的具体机制尚不完全清楚。

排卵障碍是女性生殖功能障碍的直接原因之一，卵泡发育异常是引起排卵障碍的病理基础，而卵泡发育异常与卵巢颗粒细胞（granulosa cells，GCs）的凋亡调控失常有关［5］。肥胖女性的外周血和卵泡液中存在高水平循环的氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），高水平的ox-LDL 能导致过量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成［6-7］。ROS 生成过多又是GCs损伤的主要危险因素之一［6-8］。体内有多种酶参与了ROS 生成，其中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinu⁃cleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxi⁃dase，NOX）是细胞内生成ROS 的主要酶体［9］。在肥胖育龄期女性中，体内的代谢产物是否通过影响NOX 活性来影响卵泡发育和排卵尚不清楚。Shen等［10］的研究发现，含F 框及WD 重复结构域蛋白7（F-box and WD repeat domain containing protein 7，FBW7）能通过抑制高脂饮食诱导的大鼠血管平滑肌细胞中的NOX 活性来降低ROS 的生成。近来研究发现，FBW7 可在肿瘤、动脉硬化和肥胖症等疾病模型中参与调节氧化代谢、葡萄糖代谢和脂质代谢等多种重要的生理学功能［11-13］。而在GCs 中，FBW7 是否通过调节NOX 活性参与肥胖导致的细胞损伤以及涉及的具体机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨FBW7 在ox-LDL 引起的GCs 损伤中的作用及其潜在机制。

材料和方法

1 材料与试剂

胎牛血清和DMEM 培养基购于Gibco；ox-LDL和CCK-8 细胞活力检测试剂盒购于广州奕元生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；大鼠NOX 活性检测试剂盒和人NOX 活性检测试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司；蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（cycloheximide，CHX）和蛋白酶体抑制剂MG132购于Sigma；编码FBW7 的腺病毒载体（Ad-FBW7）、LacZ 载体、pcDNA3.1-NOX1 和pcDNA3.1 购于广州锐博生物科技有限公司；抗FBW7和NOX1抗体购于Abcam；p47phox、p-p47phox、p67phox和p-p67phox抗体购于Cell Signaling Technology；GAPDH 抗体购于Santa Cruz。

2 受试者GCs的收集

收集同意参与本研究的育龄期（22～35岁）女性，并根据PCOS 诊断标准和体质指数（body mass index，BMI），将受试者分为正常体重（18.5 kg/m2＜BMI≤25 kg/m2）非PCOS 组、超重（25 kg/m2＜BMI＜30 kg/m2）非PCOS 组、肥胖（BMI≥30 kg/m2）非PCOS 组、正常体重（18.5 kg/m2＜BMI≤25 kg/m2）PCOS 组、超重（25 kg/m2＜BMI＜30 kg/m2）PCOS 组和肥胖（BMI≥30 kg/m2）PCOS组。本次研究纳入的受试者排除：（1）既往3个月有酒精和药物滥用或依赖；（2）合并严重的心血管、肝肾功能障碍、内分泌、免疫或血液系统疾病；（3）卵巢癌、库欣综合征、甲状腺功能异常、原发性卵巢早衰和药物性高雄激素血症患者。按照文献［14］描述的方法收集受试者的GCs。收集的GCs 直接用于检测FBW7表达、细胞活力和NOX活性。

3 方法

3.1 高脂饮食动物模型的建立与GCs分离 3周龄雌性SPF 级SD 大鼠购自中山大学动物实验动物中心［SCXK（粤）2016-0029］，饲养于广东药科大学实验动物中心［SYXK（粤）2017-0125］SPF 级动物房内，大鼠适应性饲养1 周后进行后续造模。大鼠分为标准饮食（standard diet，STD）组和高脂饮食（highfat diet，HFD）组。STD 饲料含15%脂肪、21%蛋白质和64%碳水化合物；HFD 饲料含60% STD 饲料、35%猪油和5%胆固醇。两组大鼠分别饲养4、8、12和16 周后，麻醉，摘取双侧卵巢，去除卵巢表面包膜和周围脂肪组织后，放入DMEM 培养基中，在解剖显微镜下，刺破卵泡，收集GCs并过200目细胞筛，制成3×109/L 密度的细胞悬液接种于细胞培养皿中（含有10%胎牛血清的DMEM 培养基）。HFD 组大鼠GCs直接用于检测FBW7 表达、细胞活力和NOX 活性，STD组大鼠GCs用于后续实验。

3.2 ox-LDL 诱导大鼠GCs 损伤模型 取STD 组大鼠GCs，按照5×107/L 密度接种于96 孔板，然后分别给予终浓度为0、20、40、80 和160 mg/L ox-LDL 处理48 h。处理后的GCs 经CCK-8 细胞活力试剂盒检测细胞的相对活力，筛选ox-LDL最佳作用浓度。

3.3 腺病毒感染大GCs 取STD 组大鼠GCs，按照5×108/L 的密度接种于6 孔板，用Ad-FBW7 或Ad-Lacz 感染（MOI=40）细胞48 h。收集已感染的细胞，再分别用或不用ox-LDL（80 mg/L）刺激细胞48 h。

3.4 pcDNA3.1-NOX1 和pcDNA3.1 转染 取已感染Ad-FBW7 的大鼠GCs，按照5×108/L 密度接种于6孔板，用HiPerFect转染试剂分别辅助转染30 μmol/L的pcDNA3.1-NOX1或pcDNA3.1，48 h后收集细胞。收集已转染的细胞，再分别用或不用ox-LDL（80 mg/L）刺激细胞48 h。

3.5 药物处理 取已感染Ad-Lacz 或Ad-FBW7 的大鼠GCs，用或不用MG132（5 mg/L）处理细胞0.5 h后，再用ox-LDL（80 mg/L）和CHX（10 mg/L）分别刺激细胞0、12、24 和48 h，收集细胞用于Western blot检测NOX1的表达。

3.6 CCK-8 法检测GCs 的活力 取分离的人GCs、大鼠GCs和已处理的大鼠GCs，调整细胞密度为每孔1×104接种于96 孔板，分别培养48 h。待测孔加入10 μL CCK-8 溶液，再孵育2 h。用酶标仪在波长490 nm处测量吸光度（A）值。

3.7 NOX 活性的检测 按照NOX 活性检测试剂盒说明书进行操作，取分离的人GCs、大鼠GCs 和已处理的大鼠GCs，分别以5×107个/mL 的密度接种于96孔板，用NADPH 裂解液冰上超声裂解20 s，然后以12 000×g离心5 min，收集上清。上清孵育光泽精（lucigenin）试剂（5 mmol/L），37℃避光孵育10 min，用光度计（Promega）测定背景的相对光单位（relative light unit，RLU）。然后加入NADPH（100 μmol/L）并反应5 min，再次用光度计测定反应的RLU。用BCA法定量上清中蛋白浓度。NOX 活性表示为单位时间（s）内单位质量（mg）蛋白的RLU。

3.8 Annexin V-FITC/PI 染色测细胞凋亡 取分离的人GCs、大鼠GCs 和已处理的大鼠GCs，跟据An⁃nexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒说明书步骤，加入500 μL 结合缓冲液并重悬细胞，然后分别加入5 μL Annexin V-FITC 和PI 染液并避光孵育10 min，流式细胞仪读取激发波长488 nm 和发射波长530 nm 处的荧光强度，并根据流式细胞仪自带软件分析其凋亡率。

3.9 Western blot 检测蛋白的表达 取分离的人GCs、大鼠GCs 和已处理的大鼠GCs，用RIPA 细胞裂解液提取蛋白。蛋白用BCA 法定量为相同浓度后，取等量的蛋白进行SDS-PAGE 分离，并将电泳分离的蛋白电转移到PVDF 膜。随后用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液将PVDF 膜在室温中封闭1 h。室温孵育1∶1 000 稀释的I 抗（NOX1、p47phox、p67phox、pp47phox、p-p67phox和GAPDH）2 h 后，用TBST 洗PVDF膜3 次。室温孵育对应的II 抗1 h，用TBST 洗PVDF膜3 次。使用避光ECL 发光液显影。用ImageJ 软件分析条带灰度值。

4 统计学处理

采用SPSS 21.0 软件包对实验数据进行分析。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），再采用SNK-q检验进行两两比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 肥胖抑制GCs的FBW7表达和细胞活力

Western blot 结果显示，在非PCOS 组中，与正常体重非PCOS 组比较，超重或肥胖非PCOS 组GCs 的FBW7 表达均显著降低（P＜0.05）；在PCOS 组中，与正常体重PCOS 组比较，超重或肥胖PCOS 组GCs 的FBW7 表达也显著降低（P＜0.05），提示肥胖能抑制GCs 中FBW7 表达，见图1A。进一步通过CCK-8 实验分析各组GCs 的活力，结果显示，不管是否PCOS患者，肥胖均能抑制GCs 的活力（P＜0.05），见图1B。

2 HFD 导致大鼠GCs 的FBW7 表达和细胞活力降低

如图2 所示，与STD 组比较，HFD 能抑制大鼠GCs 的FBW7 表达（图2A）和细胞活力（图2B），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 ox-LDL诱导大鼠GCs损伤并降低FBW7表达

如图3所示，与对照组比较，ox-LDL能抑制大鼠GCs 的FBW7 表达（图3A）和细胞活力（图3B），并促进其凋亡（图3C），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

Figure 1.The FBW7 protein expression（A）and the viability（B）of the GCs from women of reproductive age in each group.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs normal-weight non-PCOS group；#P＜0.05 vs normal-weight PCOS group.图1 各组育龄期女性GCs中FBW7表达和细胞活力的比较

Figure 2.The protein expression of FBW7（A）and the viability（B）of the rat GCs were decreased by high-fat diet（HFD）.W：weeks.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs standard diet（STD）group at the same time point.图2 HFD导致大鼠GCs的FBW7表达和细胞活力降低

4 过表达FBW7 减轻ox-LDL 诱导的大鼠GCs损伤

如图4 所示，通过感染Ad-FBW7 方式过表达大鼠GCs 中FBW7 表达（图4A）后，与单纯ox-LDL 刺激组比较，ox-LDL+Ad-FBW7 组GCs 的活力显著增强（图4B），细胞凋亡率显著降低（图4C），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

5 过表达FBW7 通过促进NOX1 降解来减弱ox-LDL诱导的GCs中NOX活性

首先检测受试者分离的GCs 的NOX 活性，结果显示，不管是否PCOS 患者，肥胖均能显著增强人GCs 中NOX 活性（P＜0.05），见图5A。在大鼠模型中，与STD 组比较，HFD 组大鼠GCs 中NOX 活性显著增强（P＜0.05），见图5B。在ox-LDL 诱导的大鼠GCs 模型中，与对照组比较，ox-LDL 诱导的大鼠GCs中NOX活性同样显著增强（P＜0.05），见图5C。

Figure 3.Stimulation with ox-LDL induced the injury of rat GCs and decreased FBW7 protein expression.The GCs isolated from nor⁃mal rats were treated with ox-LDL at concentration range of 20～160 mg/L for 48 h，and then FBW7 expression（A），cell vi⁃ability（B）and apoptosis（C）were detected by Western blot，CCK-8 assay and flow cytometry with Annexin V/PI staining，respectively.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group.图3 ox-LDL诱导大鼠GCs损伤并降低FBW7表达

进一步检测过表达FBW7 对ox-LDL 诱导的GCs中NOX 活性的影响，结果显示，与单纯ox-LDL 刺激组比较，ox-LDL+Ad-FBW7 组GCs 中NOX 活性显著降低（P＜0.05），见图6A。通过Western blot 检测NOX 关键亚基蛋白表达结果显示，与对照组比较，单纯ox-LDL刺激组GCs的p-p47phox、p-p67phox和NOX1表达均显著增加（P＜0.05）；而与单纯ox-LDL 刺激组比较，ox-LDL+Ad-FBW7 组仅NOX1 表达显著降低（P＜0.05），见图6B～E。CHX 追踪法结果显示，与ox-LDL+LacZ 组比较，ox-LDL+Ad-FBW7 组NOX1 降解显著加快（P＜0.05），见图7A。MG132 刺激GCs 结果显示，与ox-LDL+Ad-FBW7 组比较，ox-LDL+Ad-FBW7+MG132 组NOX1 表达明显增加（P＜0.05），见图7B。

6 过表达NOX1能逆转过表达FBW7对ox-LDL 诱导的GCs损伤的抑制效应

与ox-LDL+Ad-FBW7+pcDNA3.1 组比较，ox-LDL+Ad-FBW7+pcDNA3.1-NOX1 组大鼠GCs 中NOX1 表达水平显著增高（P＜0.05），见图8A，说明FBW7 与NOX1 共过表达构建成功。与ox-LDL+Ad-FBW7 组比较，ox-LDL+Ad-FBW7+pcDNA3.1-NOX1组大鼠GCs 中NOX 活性显著增强（图8B），细胞活力显著降低（图8C），细胞凋亡率显著提高（图8D），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

Figure 4.Over-expression of FBW7 attenuated ox-LDL-induced injury of rat GCs.Over-expression of FBW7 in rat GCs was con⁃ducted by infection with Ad-FBW7（MOI=40）prior to ox-LDL stimulation，and the FBW7 expression（A），cell viability（B）and apoptosis（C）were evaluated by Western blot，CCK-8 assay and flow cytometry with Annexin V/PI staining，re⁃spectively.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL stimulation alone group.图4 过表达FBW7减轻ox-LDL诱导的大鼠GCs损伤

讨 论

肥胖症是一种与血脂异常、胰岛素抵抗和氧化应激等机体代谢因素密切相关的代谢综合征。育龄期女性肥胖不仅能导致机体代谢紊乱，还会导致排卵障碍［1-2］。而肥胖引起育龄期女性排卵障碍的具体机制并不完全清楚。

Figure 5.NADPH oxidase（NOX）activity in the GCs isolated from obese women of reproductive age（A），the GCs isolated from high-fat diet（HFD）-fed rats（B），and the ox-LDL-stimulated GCs（C）.W：weeks.Mean±SD. n=10 in A；n=6 in B；n=4 in C.*P＜0.05 vs normal-weight non-PCOS group；#P＜0.05 vs normal-weight PCOS group；△P＜0.05 vs standard diet（STD）group；▲P＜0.05 vs control group.图5 肥胖育龄女性分离的GCs、HFD喂养大鼠分离的GCs和ox-LDL刺激的GCs中NOX活性

Figure 6.Over-expression of FBW7 attenuated ox-LDL-stimulated NADPH oxidase（NOX）activity through specifically inhibiting NOX1 expression.Over-expression of FBW7 in rat GCs was conducted by infection with Ad-FBW7（MOI=40）prior to ox-LDL stimulation，and the NOX activity（A）and the expression of NOX-related proteins p-p47phox，p-p67phox and NOX1（B～E）in the rat GCs were detected.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL stimulation alone group.图6 过表达FBW7通过抑制NOX1表达来减弱ox-LDL诱导的NOX活性

Figure 7.Over-expression of FBW7 accelerated NOX1 degradation in rat GCs under ox-LDL condition.A：the rat GCs were infected with LacZ or Ad-FBW7 prior to ox-LDL stimulation，cycloheximide（CHX）at 10 mg/L was added for the indicated period，and then the NOX1 expression was examined by Western blot；B：the rat GCs were pretreated with MG132 at 5 mg/L for 0.5 h followed by Ad-FBW7 infection in the absence or presence of ox-LDL，and then the NOX1 expression was examined by Western blot.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs ox-LDL+LacZ group；*P＜0.05 vs LacZ group；&P＜0.05 vs ox-LDL+Ad-FBW7 group.图7 在ox-LDL存在的情况下，过表达FBW7加速大鼠GCs的NOX1降解

卵泡闭锁是排卵障碍的直接原因，而GCs 损伤是引起卵泡发育异常和闭锁主要原因之一［5］。GCs不仅与卵巢中的卵泡膜细胞（theca cells）一起参与卵巢激素的合成和分泌，还能介导卵泡的生长、发育、闭锁和排卵［15］。GCs增殖能促进卵泡发育，而GCs凋亡则会导致卵泡闭锁，尤其是在卵泡发育的后期［15］。已有研究表明，肥胖代谢产物能导致GCs 损伤［7，16］。因此，抑制GCs 损伤可以在一定程度上减轻肥胖导致的排卵障碍。肥胖育龄期女性的体内存在氧化应激和脂代谢异常，氧化应激和脂代谢异常又能加剧不孕症发生风险。此外，氧化应激和血脂异常也与GCs 损伤有关［16-17］。因此，本研究观察不同肥胖程度对育龄期女性GCs 损伤的影响，结果显示，不管是否发生PCOS，肥胖均能导致育龄期女性的GCs 活性降低并伴随降低FBW7 表达。造成肥胖的起源因素众多，但大部分肥胖症病例是由于过度食用高脂肪食物造成的［18］。因此，本研究进一步采用HFD 构建大鼠模型，观察HFD 对GCs 的影响，结果显示HFD 能抑制GCs 活性和FBW7 表达。Liu 等［7］研究提示，肥胖导致卵泡闭锁的可能原因是卵泡液中高水平ox-LDL 导致的GCs 氧化损伤。本研究进一步用ox-LDL在体外模拟了肥胖背景下的GCs 损伤模型，结果同样显示，ox-LDL 能浓度依赖性抑制FBW7 表达。基于以上结果，我们推测FBW7 可能参与肥胖导致的GCs 损伤。为验证我们的猜想，本研究在ox-LDL 诱导的GCs 模型中证明了过表达FBW7 能通过降低细胞凋亡水平来减轻ox-LDL诱导的GCs损伤。这一结果在一定程度上证明FBW7 参与调节肥胖导致的排卵障碍。

本研究进一步探讨FBW7 参与调节ox-LDL 导致GCs 损伤的机制。尽管肥胖症的代谢产物能通过多种途径导致GCs 损伤，但氧化应激在GCs 的凋亡中起关键作用［6-7，16-17］。ox-LDL 能通过诱发GCs 中ROS过量生成进而导致GCs 氧化损伤［7］。NOX 是细胞内ROS 的主要来源［9］。在HFD 诱导的肥胖症和动脉硬化症模型中，FBW7 能通过降低NOX 活性来降低细胞内ROS 的生成［11，13］。在本研究中，我们同样发现过表达FBW7 能降低GCs 中NOX 活性。为解释FBW7 如何调节NOX 活性，我们进一步检测了NOX的关键亚基蛋白表达。本研究结果显示，过表达FBW7 对ox-LDL 诱导的p-p47phox和p-p67phox表达无明显影响，但抑制ox-LDL 诱导的NOX1 表达。这一结果提示FBW7 可能通过抑制NOX1 表达来抑制ox-LDL 诱导的NOX 活性。众所周知，FBW7 能通过介导底物蛋白的降解来广泛参与细胞的多种生物学功能［11-13］。为解释过表达FBW7导致NOX1表达降低的原因，本研究用CHX 追踪法研究了过表达FBW7 对NOX1 稳定性的影响，结果显示，在ox-LDL 刺激条件下，过表达FBW7能加速NOX1的降解。NOX家族的亚型蛋白可通过蛋白酶体降解途径快速降解［19］。本研究结果显示，在ox-LDL 刺激条件下，蛋白酶体抑制剂MG132 能恢复Ad-FBW7 导致的NOX1 表达下调。另外，外源性引入pcDNA3.1-NOX1 能逆转Ad-FBW7 对ox-LDL 诱导的GCs 损伤的抑制效应。以上结果说明，在ox-LDL 刺激条件下，过表达FBW7通过蛋白酶体降解途径促进NOX1 降解，从而降低NOX活性，减轻GCs损伤。

Figure 8.Over-expression of NOX1 reversed the inhibitory effect of over-expression of FBW7 on ox-LDL-induced injury of GCs.After co-transfected with Ad-FBW7 and pcDNA3.1-NOX1 prior to ox-LDL stimulation，the NOX1 expression（A），NOX activity（B），cell viability（C）and apoptosis（D）in rat GCs were examined.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL stimulation alone group；&P＜0.05 vs ox-LDL+Ad-FBW7 group.图8 过表达NOX1能逆转过表达FBW7对ox-LDL诱导的GCs损伤的抑制效应

综上所述，本研究表明过表达FBW7 可通过加快NOX1 降解，进而减弱NOX 活性来减轻ox-LDL 导致的GCs 损伤。另外，本研究结果还提示，上调FBW7 表达可能是肥胖症诱发的排卵障碍类疾病的一个潜在治疗策略。