邱 红，李艳红，王晓君，吕 勤

（宁波市妇女儿童医院，浙江宁波 315000）

目前，坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocoli⁃tis，NEC）仍然是构成新生儿死亡率及患病率增加的主要原因［1］。NEC 严重影响消化系统功能，甚至引起休克、酸中毒等症状［2］。由于缺乏可靠的和可预测的生物标记物，加上缺乏有效的治疗，NEC 仍是导致早产婴儿疾病的严重问题，阐明NEC 发病相关基因的潜在作用具有重要意义。摄食调节肽nesfa⁃tin-1 是一种来源于核结合蛋白2 的82 个氨基酸多肽，其在胃肠道、胰腺和内分泌腺中表达，在调节食物摄入、能量/葡萄糖稳态和肠道运动中发挥重要作用［3-4］。除了在创伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血和睾丸损伤中的抗炎和抗凋亡作用外，还有研究报道了nesfatin-1通过直接抗炎机制在胃和结肠中发挥保护作用［5］。然而nesfatin-1在NEC 胃肠道损伤中的影响尚未见报道。Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）属于TLR 家族，在免疫炎症反应中起着关键作用［6］。缺氧、手术、感染和其他应激因素触发TLR4级联并激活核因子κB 信号通路，提高趋化因子和炎症因子的表达［7］。阻断TLR4 介导的炎症反应有助于防止胃肠炎发生［8］。尽管nesfatin-1 已被报道抑制结肠炎中TLR4 信号激活［9］，但其对NEC 的影响在很大程度上是未知的。在本研究中，我们检测了在NEC 组织和LPS 诱导的肠细胞中nesfatin-1的表达水平，并评估了nesfatin-1 对免疫应答及对免疫应答的影响及其潜在机制。

材料和方法

1 材料

胎牛血清购自Gibco；DMEM/F-12 培养基购自HyClone；Lipofectamine 2000 购自Invitrogen；白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-10 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA试剂盒购自Abcam；Trizol试剂、RNA PCR试剂盒和SYBR Green I购自TaKaRa；StepOne Plus 实时荧光定量PCR 系统购自Applied Biosystems；RIPA裂解缓冲液购自Solar⁃bio；BCA 试剂盒购自Pierce；抗nesfatin-1、TLR4、NLRP3、caspase-1、黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma-2，AIM2）、含CARD 的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和GAPDH 单克隆抗体均购自Abcam；HRP 标记的Ⅱ抗购自Boehringer；ECL 购自Luminata Forte；Protein A/G购自Abcam。

2 方法

2.1 组织样本采集 2017～2019年间，从在本院接受NEC 肠道手术的20 例早产儿中获得了小肠组织。早产儿（男孩12 例和女孩8 例）的平均胎龄为30.3±1.9 周，出生体重为1202±119 g。NEC 的诊断标准参照《实用新生儿学》［2］，即：常以腹胀、便血为首发表现，可伴有呕吐、腹泻及全身症状，X 线肠壁囊样积气或门脉积气征为特征性表现。手术切除后立即采集组织样本，并将其保存在−80℃下。

2.2 细胞培养 人胎正常结肠上皮细胞HCoEpiC和人结肠癌细胞Caco-2 购自中国科学院细胞中心，接种在含有10%胎牛血清的DMEM/F-12 培养基中。HCoEpiC 细胞和Caco-2 细胞以5×107/L 接种于96 孔板中，加入100 μg/L 的LPS 处理30 min，建立肠细胞的NEC模型。

2.3 转染实验 当肠上皮细胞培养至70%～80%汇合后，使用Lipofectamine 2000 将nesfatin-1 过表达载体及其阴性对照载体，以及pcDNA-TLR4（均由上海吉玛制药技术有限公司合成）转染细胞。将所有转染的细胞培养48 h，然后进行不同的测定。Western blot检测nesfatin-1的表达确定转染效率。

2.4 ELISA检测炎症因子的浓度 使用ELISA试剂盒检测细胞中IL-6、IL-10和TNF-α的相对表达水平。通过分光光度法测定450 nm 处吸光度（A）。根据标准曲线计算炎症因子浓度。

2.5 RT-qPCR 分析 使用Trizol试剂从小肠组织或细胞中提取总RNA。使用RNA PCR试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后使用StepOnePlus实时荧光定量PCR 系统进行实时定量PCR。PCR 反应混合物使用SYBR Green I、cDNA 和引物。使用常规2−ΔΔCt法计算目的基因的表达变化。TNF-α的上游引物序列为5′-CGCCTCACCTGACCTACC-3′，下游引物序列为5′-TTGCCTCGTTCTGGACTATAC-3′；IL-6 的上游引物序列为5′-CACCTATGCCACCCTTATCC-3′，下游引物序列为5′-CGAACATGCGAGTAAACCAA-3′；IL-10 的上游引物序列为5′-ATGCTGCCTGCTCTTACT⁃GACTG-3′，下游引物序列为5′-CCCAAGTAACCCT⁃TAAAGTCCTGC-3′；nesfatin-1的上游引物序列为5′-CCTATGCCCTAAGAAACCCC-3′，下游引物序列为5′-GAAGCAGTTTGGGACCCCTT-3′；TLR4的上游引物序列为5′-ACCTGTCACTGTCTTGTACCCTTGT-3′，下游引物序列为5′-CGGCGTTTGGAGTGG⁃TAGAA-3′；GAPDH的上游引物序列为5′-AGCAAT⁃GCCTCCTGCACCACCAAC-3′，下游引物序列为5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′。

2.6 Western blot 分析 用RIPA裂解缓冲液裂解肠细胞。通过BCA 法测定蛋白浓度。在100℃下用加载缓冲液将裂解物变性5 min，然后在SDS-PAGE（12%）上加载相同的蛋白质并转移到PVDF 膜上，用阻断剂消除非特异性染色。这些膜用Ⅰ抗［nesfatin-1（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、cas⁃pase-1（1∶1 000）、AIM2（1∶1 500）、ASC（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）］在4℃封闭过夜。然后用PBS 洗涤，并用HRP标记的II抗和ECL孵育观察目标条带。

2.7 免疫共沉淀实验 用RIPA 裂解缓冲液对HCoEpiC 细胞进行裂解。用PBS 稀释Protein A/G-琼脂糖至50%的工作浓度。然后将溶液加入样品（100 mL/L）中，在4℃下摇匀10 min。14 000×g离心10 min 后，收集上清液转移至新离心管中。用BCA法测定蛋白质浓度。加入兔抗nesfatin-1 IgG 抗体或对照兔IgG 室温孵育2 h，分别加入Protein A/G（1∶50）10 μL 孵育1 h。离心收集沉淀进行电泳并对TLR4蛋白进行Western blot分析。

3 统计学处理

数据用平均值±标准差（mean±SD）表示。用t检验法比较组织标本和肠上皮细胞中nesfatin-1 的表达。采用双向方差分析法分析nesfatin-1对炎症的影响。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 在NEC 组织和LPS 诱导的肠细胞中nesfatin-1的mRNA表达下调

如图1A 所示，NEC 早产儿组织中nesfatin-1的表达明显低于健康组（P＜0.01）。此外，与对照组相比，LPS 诱导的肠上皮HCoEpiC 细胞和HT-29 细胞中的nesfatin-1表达降低（P＜0.01），见图1B。

Figure 1.The mRNA expression of nesfatin-1 was detected in NEC tissues（A）and LPS-induced intestinal epithelial cells（B）.The mRNA expression of nesfatin-1 was detected by RT-qPCR.Mean±SD.##P＜0.01 vs healthy group；**P＜0.01 vs control group.图1 在NEC患儿组织和LPS诱导的肠上皮细胞中检测nesfatin-1的mRNA表达水平比较

2 nesfatin-1 减弱LPS 刺激肠细胞中炎症因子和相关蛋白的表达

为了确定nesfatin-1 对炎症因子的影响，研究检测了LPS 刺激肠细胞中TNF-α、IL-10、IL-6 和NLRP3的表达。分别用阴性对照（NC）和pcDNA-nesfatin-1（nesfatin-1）转染细胞，然后用100 μg/L 的LPS 刺激，通过Western blot 分析显示，与NC 转染组相比，nes⁃fatin-1 转染组中nesfatin-1 蛋白表达显著提高（P＜0.05），并且LPS 刺激显著降低nesfatin-1 蛋白的表达（P＜0.05），而nesfatin-1 转染逆转了LPS 的刺激作用（图2A、B）。ELISA 结果表明，nesfatin-1 的过表达降低了TNF-α 和IL-6 的水平（P＜0.05），并增加了IL-10的水平（P＜0.05），见图2C～E。此外，在HCoEpiC 细胞和HT-29 细胞中，nesfatin-1 转染抑制了NLRP3、AIM2、caspase-1和ASC的表达（图2F）。

3 nesfatin-1与TLR4的交互作用

本研究中，TLR4 在NEC 组织样本中的表达明显高于健康婴儿（P＜0.05），见图3A。Pearson相关分析表明，nesfatin-1 和TLR4 之间存在显著负相关（r=−0.816，P＜0.01），见图3B。nesfatin-1 转染逆转了LPS 诱导的HCoEpiC 细胞和Caco-2 细胞中TLR4 蛋白的表达增加（P＜0.05），见图3C。此外，通过免疫沉淀发现TLR4与nesfatin-1能够在细胞内共沉淀，见图3D。

Figure 2.Nesfatin-1 inhibited the expression of inflammatory factors and related proteins in the HCoEpiC cells and Caco-2 cells with LPS stimulation.A and B：over-expression efficiency of nesfatin-1 was investigated by Western blot；C～E：ELISA was used to measure the contents of TNF-α，IL-6 and IL-10 in the HCoEpiC cells and Caco-2 cells；F：the protein expression of NLRP3，AIM2，caspase-1 and ASC was investigated by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 NC+LPS group；△P＜0.05 vs HCoEpiC-NC group；▲P＜0.05 vs Caco-2-NC group.图2 nesfatin-1抑制LPS刺激下HCoEpiC细胞和HT-29细胞炎症因子和相关蛋白的表达。

4 TLR4逆转nesfatin-1对炎症反应的影响

进一步分析了TLR4 在HCoEpiC 细胞炎症反应中的作用。用特异性质粒载体转染HCoEpiC 细胞，转染48 h后采集标本，用RT-qPCR法测定IL-6、IL-10和TNF-α 的mRNA 水平，Western blot 检测NLRP3、AIM2、caspase-1 和ASC 的蛋白水平。结果表明，TLR4 转染促进LPS 诱导的HCoEpiC 细胞IL-6 和TNF-α 的表达（P＜0.05），并消除了nesfatin-1 对HCo⁃EpiC 细胞IL-10 表达的增强作用（P＜0.05），见表1。此外，TLR4 的过表达进一步促进了LPS 诱发的NL⁃RP3 升高，并逆转了nesfatin-1 对NLRP3、AIM2、cas⁃pase-1和ASC蛋白水平的抑制作用，见图4。

讨 论

随着新生儿重症监护技术的发展，早产儿的存活率明显提高，然而这些新生儿的NEC 发病率也相应上升［10］。NEC 的发病机制，包括从轻度炎症到肠坏死并多器官功能衰竭，目前尚不清楚。在重症监护期间，缺血、缺氧和缺乏母乳喂养，破坏了已经不成熟的肠道屏障，氧化应激、感染与炎症反应产生或释放的氧自由基、炎性细胞因子活化与NEC 明显相关［11］。因此，大量关于NEC 预防和治疗的研究集中于增强抗炎防御和限制炎症损伤药物的应用［12］。nesfatin-1 是细胞因子信号转导的关键调节因子，在细胞免疫应答和炎症性疾病中发挥作用［3］。王鼎元等［13］研究表明，nesfatin-1 对巨噬细胞的自身免疫炎症有负调节作用。此外，nesfatin-1 被认为是胃肠道炎症的重要介质［14］。胃上皮细胞nesfatin-1基因敲除促进胃炎的发生［3］；而nesfatin-1 的过度表达提高了结肠上皮细胞的伤口愈合能力，并降低了溃疡性结肠炎的病变风险［4］。本研究结果证实Nesfatin-1 在NEC 婴儿组织样本和LPS 诱导的肠细胞中下调，并减轻NEC的作用。

Figure 3.Nesfatin-1 interacted with TLR4.A：the mRNA expression of TLR4 in intestinal epithelial cells was detected by RTqPCR；B：the relation between nesfatin-1 and TLR4 was determined by Pearson analysis in the intestinal epithelial cells；C：the cells were transfected with NC or nesfatin-1，and then the protein expression of TLR4 in HCoEpiC cells and Caco-2 cells was detected by Western blot；D：the images of co-immunoprecipitation assay showed nesfatin-1-TLR4 interaction.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs healthy group；#P＜0.05 vs NC+LPS group.图3 nesfatin-1与TLR4交互作用的验证

表1 TLR4逆转了nesfatin-1对肠细胞炎症反应的影响Table 1.TLR4 reversed the effect of nesfatin-1 on intestinal inflammatory responses（Mean±SD. n=3）

nesfatin-1 在各种胃肠道疾病中异常表达，可通过靶向多种转录因子介导免疫应答［4］。Xia 等［15］研究证实血浆nesfatin-1 水平升高与皮质酮、IL-6 和CRP 水平降低有关。nesfatin-1 负性调节CD33 的表达，导致炎症细胞因子的表达减少［16］。本研究发现，在HCoEpiC 细胞和HT-29 细胞中，nesfatin-1 转染抑制了LPS刺激诱导的NLRP3、AIM2、caspase-1和ASC蛋白的表达。NLRP3炎症小体是研究最多的炎症小体，其持续和过度激活导致急性和慢性炎症疾病的爆发。通常当炎症小体被刺激激活时，激活的炎症小体会将caspase-1 前体切割成caspase-1。caspase-1反过来又调节促炎细胞因子如IL-6 和TNF-α 的成熟，过量的IL-6 可导致各种炎症疾病［17］。AIM2 是识别微生物或宿主来源dsDNA 的胞质传感器之一，其过度激活导致自身免疫性疾病的发展［18］。在炎症小体复合物形成过程中，集合适配器ASC 是与NLRP3、AIM2 结构域和caspase-1 前体相互作用的衔接蛋白［19］。

Figure 4.The protein expression of NLRP3，AIM2，caspase-1 and ASC was determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs LPS group；#P＜0.05 vs nesfatin-1+LPS group.图4 Western blot检测NLRP3、AIM2、caspase-1和ASC蛋白的表达

近年来，nesfatin-1在TLR4应答中的作用引起了研究者的关注。Roth 等［20］研究证明，TLR4 应答是由nesfatin-1介导的，nesfatin-1阻断核移位和转录活性。沙格列汀可提高nesfatin-1 的表达，抑制炎症反应，TLR4 抑制剂可减弱沙格列汀对nesfatin-1 的促进作用［21］。在本研究中，我们发现nesfatin-1直接与TLR4结合，抑制LPS 诱导的免疫反应。进一步分析显示，TLR4 的转染促进LPS 诱导的HCoEpiC 细胞IL-6、TNF-α 和NLRP3 的表达升高，并消除了nesfatin-1 对HCoEpiC 细胞IL-10 表达的增强作用以及nesfatin-1对NLRP3、AIM2、caspase-1 和ASC 蛋白表达的抑制作用。结果表明nesfatin-1 通过靶向TLR4 介导LPS诱导的肠细胞炎症反应。

综上所述，本研究表明nesfatin-1 在NEC 和LPS诱导的肠上皮细胞中表达较低。nesfatin-1的过度表达减弱了HCoEpiC 细胞和HT-29 细胞的炎症反应。此外，nesfatin-1 通过靶向TLR4 介导炎症反应保护肠细胞免受LPS 诱导的炎症反应损伤，可能成为抗NEC治疗的潜在靶点。