张吟眉，郝新杰，郑佳佳

（北京大学第三医院检验科，北京 100191）

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangi⁃tis，PBC）是一种渐进性发展的慢性自身免疫性胆汁淤积性肝病，以淋巴细胞性胆管炎，肝内小胆管逐渐破坏，导致纤维化为主要特征，并可能通过并发症导致肝硬化［1］。PBC 发病机制复杂，目前临床尚缺乏PBC 早期诊断理想的分子标志物以及监测PBC 疾病进展以及治疗效果的有效指标［2-3］。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类共价闭合的非编码RNA 分子，具有较高的核糖核酸酶R（ribonuclease R，RNase R）抗性和较长的半衰期，并以组织和发育阶段特异性方式表达［4-5］。circRNA 具有生物调控功能，可以作为微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的分子海绵以调控miRNA 对靶基因表达的干预，是一种潜在的理想的疾病诊断标志物和治疗靶标［6-7］。我们前期分析了PBC 患者circRNA 表达谱芯片，发现22 条差异表达的circRNA，hsa_circ_087631 是其中丰度较高且表达均一的circRNA 之一［8］。通过芯片生物信息学分析获得与circRNA 结合的miRNA，并对miRNA 靶基因进行预测，显示在hsa_circ_087631 与miR-346 上存在结合位点。为揭示hsa_circ_087631 和miR-346 是否参与PBC 的发病机制，我们观察了hsa_circ_087631 在PBC 患者中的表达，并初步探讨了其作用机制。

前期我们通过文献检索联合芯片和RT-qPCR 检测，证实了miR-346在PBC 患者外周血T淋巴细胞的表达显著低于健康对照组。有研究表明，滤泡辅助性T 细胞（follicular helper T cells，Tfh）和滤泡调节性T细胞（follicular regulatory T cells，Tfr）的比例失衡可以导致多种自身免疫性疾病［9-10］。本课题组的前期研究发现，PBC患者相对于健康者Tfh细胞比例显著升高，Tfr 细胞比例下降［11］。有文献报道，Tfh17 和Tfh2 能够通过分泌白细胞介素21（interleukin-21，IL-21）辅助B 细胞产生免疫球蛋白［12］；又有文献表明，miR-346能通过抑制Bcl-6，调控自身免疫性疾病中循环CD4+CXCR5+Tfh 细胞的比例［13］。因此，我们试图研究在PBC 患者中是否存在hsa_circ_087631/miR-346/Bcl6 或hsa_circ_087631/miR-346/IL-21 的 信号转导，通过调控CD4+CXCR5+Tfh 细胞参与PBC 的进展，以及对预测的circRNA-miRNA-mRNA 通路的潜在功能进行探索，为探索PBC 新的靶向治疗方法提供依据。

材料和方法

1 队列收集

实验对象为2018 年～2019 年北京大学第三医院消化科门诊和住院PBC 患者30 例，以及性别、年龄匹配的健康对照者30 例。所有入组个体均进行肝功能、抗线粒体抗体（antimitochondrial antibodies，AMA）、免疫球蛋白及肝脏B 超检测，并排除HBV 和HCV 感染，队列的临床特征见表1。所有患者及健康对照者全部填写知情同意书。所有个体采集外周静脉抗凝血进行后续检测。

表1 PBC患者和健康对照者的临床特征Table 1.Clinical characteristics of PBC patients and healthy controls

2 主要试剂

TRIzol 和Lipofectamine 2000（Invitrogen）；逆转录试剂盒、SYBR Green Mix、SDS loading buffer 和RNase free water（TaKaRa）；DMEM/F12培养基、胎牛血清、Opti-MEM®I Reduced Serum Medium 和0.25%EDTA-胰蛋白酶（Gibco）；Polyethylenimine MAX（Polysciences）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）；所用引物由上海生工公司合成，序列见表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 主要方法

3.1 构建过表达hsa-miR-346 的慢病毒pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS 将hsa-miR-346 模板DNA 定向插入慢病毒pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Pu⁃ro-CMV-MCS 载体（记为H145）中，构建过表达hsamiR-346 的慢病毒 pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（记为H9113），并转染到293TN细胞中。

3.2 RT-qPCR 实验 采用TRIzol 法从细胞中提取总RNA，取1.0 μg 总RNA，用oligo（dT）和random primers 逆转录出cDNA 用于检测hsa-miR-346、hsa_circ_087631、Bcl-6 mRNA 和IL-21 mRNA 表达水平。以GAPDH 为内参照。在ABI PRISM®7500 Se⁃quence Detection System（Applied Biosystems）进行PCR和数据分析。以2−ΔΔCt法计算相对表达水平

3.3 双萤光素酶报告基因系统检测hsa_circ_087631 与hsa-miR-346 的结合 参照已报道方法构建包含hsa-miR-346 潜在结合序列的hsa_circ_087631 重组萤光素酶报告质粒pGL3-hsa_circ_087631-761-781 及包含突变了结合序列的重组质粒pGL3-hsa_circ_087631-761-781-Mut。将293T细胞按70%的汇合度接种到96 孔板，24 h 后转染萤光素酶报告基因质粒和miRNA，每个样品设置6 个复孔，转染48 h后，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞1次。每孔加入50 μL 的1× Passive Lysis Buffer 裂解液，常温条件摇床晃动15 min；裂解液转移到白色不透光的96 孔酶标板中，加入100 μL 预先混好的LAR II，设置荧光发光仪程序，检测萤火虫萤光素酶的活性；向检测管中加入100 μL Stop&Glo®试剂，检测海肾萤光素酶活性。两种萤光素酶活性比值的变化可反映hsa_circRNA_08763与hsa-miR-346结合情况。

4 统计学处理

计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，用SPSS 20.0 统计软件进行分析。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni 校正的t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 PBC患者外周血hsa_circ_087631水平显著升高

本研究选取30 例PBC 患者和30 例健康对照者血浆标本进行检测，结果显示，PBC 患者的hsa_circ_087631 水平与健康对照者相比显著升高（P＜0.05），见图1。

Figure 1.The expression of hsa_circ_0087631 in the peripheral blood from PBC patients and healthy controls was de⁃tected by RT-qPCR.Mean±SD. n=30.*P＜0.05 vs healthy control group.图1 PBC 患者和健康对照者外周血hsa_circ_0087631 表达水平的比较

2 hsa-miR-346 在Jurkat 细胞过表达后hsa_circ_0087631表达降低

通过芯片生物信息学分析，我们发现在PBC 外周血中高表达的hsa_circRNA_087631 与miR-346 存在结合位点。接下来我们验证两者是否存在调控作用。将目的基因hsa-miR-346 插入空载体pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（H145），成功构建hsa-miR-346 过表达的慢病毒pLenti-EF1a-EGFPF2A-Puro-CMV-MCS（H9113），见图2A。该慢病毒感染293TN 细胞的效果如2B 所示，H9113 能够稳定过表达hsa-miR-346，见图2C。将该慢病毒以MOI=60感染人急性T细胞白血病Jurkat细胞后，与空载体对照Jurkat-H145 组相比，转染H9113 的Jurkat-H9113 组中hsa-miR-346 的表达水平显著增高（P＜0.01），而hsa_circ_087631 的表达水平降低（P＜0.01），见图2D、E。

Figure 2.The expression of hsa_circ_0087631 was decreased after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector was transfected into the Jurkat cells.A：the structural diagram of blank vector pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（H145）and hsamiR-346-overexpressing lentiviral vector pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS（H9113）；B：the cell infection rate of H145 and H9113（48 h after transfection，×200）；C：the expression of hsa-miR-346 in 293TN cells after transfection；D：the expression of hsa-miR-346 after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector H9113 was transfected into the Jurkat cells；E：the expression of hsa_circ_087631 after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector H9113 was transfected into the Jurkat cells.Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs H145 group；**P＜0.01 vs Jurkat-H145 group.图2 hsa-miR-346过表达慢病毒降低Jurkat细胞中hsa_circ_0087631表达

3 hsa-miR-346对Bcl-6和IL-21的调控

我们进一步验证miR-346 是否对下游靶基因Bcl-6和IL-21存在调控。将hsa-miR-346 过表达慢病毒质粒H9113 以MOI=60 感染Jurkat 细胞后，Jurkat-H9113 组Bcl-6 和IL-21 的mRNA 表达均显著降低（P＜0.05），见图3。这提示hsa-miR-346 对下游基因Bcl-6和IL-21存在调控作用。

4 验证hsa_circ_0087631与hsa-miR-346的相互作用

我们通过双萤光素酶报告基因系统检测hsamiR-346和hsa_circ_087631是否存在相互作用，再结合定点突变技术确定miRNA 与靶基因的作用位点。构建hsa_circ_087631 野生型质粒（pMIR-REPORThsa_circ_087631 3´UTR-WT，H7168）和hsa_circ_087631 双突变质粒（pMIR-REPORT-hsa_circ_087631 3´UTR-Mut，H7169），其中hsa_circ_087631双突变位点针对生物信息学预测的hsa-miR-346 与hsa_circ_087631 结合的两个靶位点进行突变，见图4A。将H7168 及H7169 分别与hsa-miR-346 mimics共转染至293T 细胞，hsa-miR-346 可显著降低野生型hsa_circ_087631 的萤光素酶活性（P＜0.01）；而在结合位点突变后，这种调控关系仍然存在（P＜0.01），见图4B。由此推测该miRNA 可能不是通过我们预测的结合位点调控了萤光素酶的表达。上述结果证实hsa_circ_087631 与hsa-miR-346 的确存在相互作用，hsa-miR-346 抑制了hsa_circ_087631 的表达，但结合位点需要进一步通过实验验证。

Figure 3.The mRNA expression of Bcl-6 and IL-21 after the hsa-miR-346-overexpressing lentiviral vector was transfected into the Jurkat cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Jurcat-H145 group.图3 hsa-miR-346过表达对Jurkat细胞中Bcl-6和IL-21表达的影响

Figure 4.Dual-luciferase reporter assay was performed to identify the interactions between hsa_circ_087631 and hsa-miR-346.A：the schematic diagram of double mutant hsa_circ_087631 vector（H7169）；B：relative luciferase activity in dual-luciferase reporter assay.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs H7168+NC group；##P＜0.01 vs H7169+NC group.图4 双萤光素酶报告基因实验验证hsa_circ_0087631与hsa-miR-346的相互作用

讨 论

PBC 是一种慢性胆汁淤积性自身免疫性疾病，可进展为终末期肝病，其发病机制复杂，目前临床尚缺乏PBC 早期诊断理想的分子标志物以及监测PBC疾病进展和治疗效果的有效指标［15］。

circRNA 是一类具有调控基因表达作用的特殊的内源性非编码RNA，在进化上高度保守［5］，与线性的mRNA 相比有更好的稳定性。circRNA 在外周血中稳定存在，参与免疫细胞发育和免疫调节的多个阶段，不仅可以作为诊断人类自身免疫性疾病的生物标志物，还可以代表疾病的活动性或严重程度。miRNA 是一种内源性的小分子非编码RNA，广泛参与生物体的生长、凋亡等的调控，与多种自身免疫性疾病的发展密切相关，circRNA 可通过作为miRNA的分子海绵调控许多生物学过程，包括DNA 甲基化、免疫反应和炎症反应，与多种自身免疫性疾病的相关［16-18］。

在前期工作中，我们通过比较PBC 患者及性别年龄匹配的健康对照者外周血血浆中circRNA 表达谱芯片分析以及聚类分析，发现了22 条差异表达的circRNA，其中hsa_circ_087631 是外周血中高表达的circRNA 之一。本研究中我们再次通过RT-qPCR 对芯片结果进行验证，结果证实hsa_circ_087631 在PBC 患者外周血中相对于健康对照者表达升高。将hsa-miR-346过表达慢病毒感染人急性T细胞白血病Jurkat 细胞后，hsa_circ_087631 表达降低，提示hsa_circ_0087631 可能通过调控hsa-miR-346 发挥作用。

Tfh 细胞作为新近发现的效应T 细胞亚群，辅助生发中心B 细胞产生抗体，其调节抗体生成的促生发中心反应可被Tfr 细胞抑制。多种自身免疫病的发生与Tfr 细胞分化不足、Tfh 数量增多及Tfr/Tfh 比值失衡有关［19-20］。本课题前期研究结果发现PBC 患者相对于健康者Tfh 细胞比例显著升高，Tfr 细胞比例下降，Tfr/Tfh比值显著降低［11］。

Chen（陈娟）等［13，21］报道了miR-346 对Bcl-6 有调控作用，而黄勇武等［22］的研究表明IL-21 可能通过调节Th17/Treg 平衡而参与了PBC 的发病机制。IL-21 可介导多种生物学效应的细胞因子，主要由活化的CD4+T 辅助细胞等合成和分泌，同时也可促进Tfh17 和Tfh2 分化、B 细胞转化为浆细胞以及免疫球蛋白的分泌，与多种自身免疫性疾病发病有关［22-23］。Bcl-6 主要表达于生发中心的B 细胞和CD4+T 细胞，参与调节T 细胞依赖的抗原反应。有研究显示miR-346 在PBC 患者外周血T 细胞中显著低于健康者，并可能参与了PBC 的发病过程［24］，其机制可能是通过在转录水平和翻译水平抑制Bcl-6，从而调控自身免疫病中循环CD4+CXCR5+Tfh 细胞的表达情况［13］。本研究中，将hsa-miR-346 过表达慢病毒感染Jurkat细胞后，Bcl-6和IL-21的mRNA表达均显著降低。这提示在人T 细胞中可能存在hsa_circ_0087631/hsamiR-346/Bcl-6 或hsa_circ_0087631/hsa-miR-346/IL-21 功能关联的调控。hsa_circ_0087631 可能通过下调hsa-miR-346，调控下游靶基因Bcl-6和IL-21，上调Tfh细胞比例，从而在PBC的发病过程中发挥作用。

接下来，我们通过双萤光素酶报告基因系统研究hsa-miR-346 与hsa_circ_087631 的相互作用，并结合定点突变技术确定miRNA 与靶基因的作用位点。将野生型及双突变的hsa_circ_087631 质粒分别与hsa-miR-346 mimics 共转染至293T 细胞后，hsa-miR-346 可显著降低野生型hsa_circ_087631 的萤光素酶活性，而在结合位点突变后，这种调控关系仍然存在。上述实验结果证实了hsa-miR-346 与hsa_circ_087631 之间存在特异结合作用，但可能不是通过我们预测的结合位点调控萤光素酶的表达。在下一步的实验中，我们将应用多数据库，交叉预测hsa-miR-346 与hsa_circ_087631 之间的作用位点，继续探明hsa_circ_087631在PBC中作用的确切分子机制。

综上所述，本研究探索了参与自身免疫病理进程重要的Tfh 细胞相关的circRNA 在PBC 中的表达及其与上下游调控分子相互作用的机制。此类研究在国内外尚无报道，在相关研究领域属于首创，具有一定的创新性和科学价值，为探索PBC 新的靶向治疗方法提供理论依据。本研究也存在一定局限性，circRNA 可能影响的潜在下游靶基因对细胞功能的作用以及circRNA 与miR-346 的正确结合位点还有待进一步深入研究。