马冬雪，高维娟，刘真一，张红军，王嘉颖，董贤慧△

（1河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北石家庄 050091；2承德医学院病理生理学教研室，河北承德 067000）

脑部出现老年斑是阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）的主要病理学标志［1］，其核心成分是β-淀粉样蛋白（amyloid-β peptide，Aβ）［2］，Aβ 是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）水解代谢产生的［3］。去整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）被认为是APP 的非淀粉样剪切中重要的分泌酶［4］，ADAM10的表达变化影响着AD的发生发展。

AD 患者的脑铁水平异常升高［5-6］，异常增高的脑铁启动机体级联放大机制，最终导致神经元死亡［7］。降低增高的脑铁是防治AD 的一个有效方法。铁调素（hepcidin，HAMP）是近年来发现的铁调节激素，但HAMP 是否通过调节AD 患者脑铁代谢干预APP淀粉样代谢通路，目前尚未见报道。

中医认为AD 发病是以肾虚精亏、气血不足为本，痰瘀互结、浊毒内生为标的本虚标实之证。根据中医“标本兼治”的治疗原则，治疗AD 应补肾健脾，益气养血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其标。本课题组前期研究显示，应用淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以有效上调AD 模型小鼠HAMP 的表达［8］，缓解小鼠脑组织铁超载，下调AD 小鼠模型Aβ的表达和减少SP 的沉积［9］，但其具体机制仍然不明确。因此，本课题组以Aβ25-35诱导HT22细胞为AD细胞模型，采用免疫荧光、qPCR 和Western blot 方法检测淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方介导HAMP 对小鼠海马神经元细胞系HT22 细胞APP 水解中关键酶ADAM10 表达的影响，为揭示淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方防治AD的内在机制提供参考资料。

材料和方法

1 细胞株

小鼠海马神经元细胞系HT22 由河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室提供。

2 药品、试剂及仪器

黄芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素由南京泽朗医药科技有限公司提供。DMEM 高糖培养液购自Gibco；Triton X-100 购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；ADAM10抗体购自Abcam；OPTI-MEM Amyloid Precursor®I（1×）购自Gibco；Lipofectamine®3000 购自Invitro⁃gen；Aβ25-35购自Sigma；CCK-8 试剂盒购自庄盟国际生物基因科技有限公司。

3 方法

3.1 HT22 细胞的培养、分组及处理 HT22 细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培养液放入细胞培养瓶中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱，待细胞融合至80%～90%时即可传代。取形态良好、对数生长期的HT22 细胞用于后续实验。

Aβ25-35配制方法：将1 mg Aβ25-35溶于943 μL 三蒸水，配成1 000 μmol/L 母液，置于37℃培养箱孵育7 d，使之老化，分装，于-20℃冻存。用Aβ 的活性片段Aβ25-35诱导HT22细胞建立AD细胞模型。

确定淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方作用浓度和沉默效果后，将HT22 细胞以每孔2×105个的密度接种于6 孔板，培养12 h 待细胞贴壁后随机分为7组：正常对照组（不添加任何药物的等体积的完全培养液）、Aβ 组（加入Aβ25-35处理HT22 细胞24 h 建立AD 细胞模型）、RNAi 组（HT22 细胞转染HAMPsiRNA-3）、Aβ+RNAi 组（加入Aβ25-35处理HT22 细胞24 h 后转染HAMP-siRNA-3）、Aβ+TCM 组（加入Aβ25-35处理HT22细胞24 h后加入淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方处理24 h）、RNAi+TCM 组（HT22 细胞转染HAMP-siRNA-3 24 h 后加入淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方处理24 h）和Aβ+RNAi+TCM 组（加入Aβ25-35处理HT22 细胞24 h 后转染HAMP-siRNA-3 24 h，然后加入淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方处理24 h）。根据课题组前期实验证明，以淫羊藿、黄芪、葛根提取的有效组分复方（淫羊藿苷、黄芪甲苷、葛根素成分按照3∶2∶2的比例用药）。

3.2 CCK-8 法检测淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方的细胞毒性 HT22 细胞以每孔2.5×103个的密度接种于96 孔板，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培养液进行培养，培养24 h后加入不同浓度的淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方，3 种药物的比例按其单体的物质的量浓度确定为3∶2∶2，最终于药物复方组分中取一定的量用于后续实验。实验分组为对照组和中药组。中药组设定药物剂量分别为7.4、14.8、22.2、29.6 和37 mg/L，作用24 h 后，观察细胞存活情况，在每孔中加入10 μL CCK-8 检测试剂，避光，在37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，在多功能微孔板读数仪中测定A450值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A值−空白对照组A值）/（对照组A值−空白对照组A）×100%。另外根据研究，Aβ25-35理想造模浓度和处理时间分别为40 μmol/L和24 h［10］。

3.3HAMP基因沉默

3.3.1 siRNA 的设计、合成及转染 siRNA 由中洪博元生物技术有限公司提供，根据HAMP基因在Gen-Bank 中的序列设计合成HAMPsiRNA，如表1所示。

表1 HAMP siRNA序列Table 1.The sequences of HAMP siRNA

将HT22 细胞接种在6 孔板上，待细胞融合度达到70%时，进行转染，具体操作按Lipofectamine®3000 转染试剂操作说明书进行。细胞分为：正常对照（control）组、NC（转染siRNA 阴性对照）组、Si-1（转染HAMP-siRNA-1）组、Si-2（转染HAMP-siRNA-2）组和Si-3（HAMP-siRNA-3）组。转染48 h 后做Western blot和qPCR验证。

3.3.2 qPCR和Western blot检测HAMP表达水平按照试剂盒提取各组RNA，并反转录为cDNA。引物序列见表2。PCR 条件为：95℃30 s→（95℃5 s→60℃30 s）×40 个循环。待测样品的目的基因相对表达量用2−ΔΔCt表示。

表2 qPCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for qPCR

提取各组细胞总蛋白，BCA 法进行蛋白定量。电泳后转移到0.45 μm 的PVDF 膜上，5%牛奶封闭2 h，加入兔抗β-actin 和兔抗HAMP，4℃孵育过夜，洗膜。滴加相应Ⅱ抗，室温孵育1 h，洗膜显影。采用ImageJ软件分析测量灰度值。

3.4 免疫荧光、Western blot 和qPCR 检测ADAM10的表达 将盖玻片用多聚赖氨酸包被，分组处理后的细胞种植于包被好的玻片上，制备细胞爬片，然后进行造模及给药处理。细胞爬片采用4%多聚甲醛固定20 min；1% Triton X-100 破膜，Ⅰ抗孵育过夜；PBS 洗去Ⅰ抗后，滴加相应Ⅱ抗，避光室温孵育50 min；PBS 洗去Ⅱ抗后，滴加DAPI 染液，避光室温孵育10 min，封片。每张片子随机选取3个视野进行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析。

细胞处理后，收集各组处理后的HT22 细胞，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白样品加入上样缓冲液，100℃煮沸5 min 使其变性。离心（1 000×g，10 min）取上清液进行SDS-PAGE。将电泳后分离的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h。TBST 清洗，加入相应的Ⅰ抗，4℃过夜。TBST 清洗后加入Ⅱ抗，室温下孵育2 h。TBST 清洗后ECL 显影，于凝胶成像系统扫描拍照。采用ImageJ软件分析测量灰度值。

细胞处理后，收集各组处理后的HT22 细胞，使用PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒提取总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA 为模板进行扩增。实时荧光定量PCR 采用TaKaRa 的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）试剂盒进行，并用荧光定量PCR 仪进行扩增和监测，用2−ΔΔCt表示待测样品目的基因相对表达量。ADAM10和内参照GAPDH的引物序列见表3。

表3 qPCR引物序列Table 3.Sequences of the primers for qPCR

4 统计学处理

所有实验数据均采用SPSS 22.0软件进行分析。数据以均数±标准差（mean±SD）来表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度的淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对细胞存活率的影响

在进行细胞实验之前，首先对淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方的细胞毒性进行考察，与control 组相比，不同浓度（7.4、14.8、22.2、29.6 和37 mg/L）的淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方作用于细胞24 h后，均没有引起显著的细胞毒性，且各组细胞存活率无显著性差异，故采取37 mg/L 的药物浓度用于后续实验，见图1。

Figure 1.Effect of traditional Chinese medicine（TCM；active components of Epimedium，Astragalus and Radix Puerariae）on HT22 cell survival rates.Mean±SD.n=6.图1 淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对HT22 细胞存活率的影响

2 siRNA对HT22细胞HAMP表达水平的影响

与control 组比较，NC 组HAMP 蛋白和mRNA 表达水平无显著差异（P＞0.05），Si-1 组、Si-2 组和Si-3组HAMP 蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与NC 组比较，Si-1 组、Si-2 组和Si-3 组HAMP蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与Si-1组比较，Si-2 组和Si-3 组HAMP 蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与Si-2 组比较，Si-3 组HAMP 蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；其中HAMP siRNA-3 序列干扰效率最强，因此选用HAMP siRNA-3序列进行后续实验，见图2。

Figure 2.The effect of siRNA on the HAMP protein and mRNA expression levels in HT22 cells.A：the protein ex⁃pression of HAMP；B：the mRNA expression of HAMP.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NC group；△P＜0.05 vs Si-1 group；▲P＜0.05 vs Si-2 group.图2 siRNA 对HT22细胞HAMP 蛋白和mRNA 表达水平的影响

3 免疫荧光检测ADAM10的表达

与control 组比较，Aβ 组、RNAi 组和Aβ+RNAi 组中的ADAM10蛋白表达降低（P＜0.05）；与Aβ组比较，Aβ+RNAi 组中ADAM10 蛋白表达进一步降低（P＜0.05），Aβ+TCM 组中ADAM10 蛋白表达增高（P＜0.05）；与RNAi 组比较，Aβ+RNAi 组中的ADAM10蛋白表达降低（P＜0.05），RNAi+TCM 组中的AD⁃AM10蛋白表达增高（P＜0.05）；与Aβ+RNAi组比较，Aβ+RNAi+TCM 组中的ADAM10 蛋白表达增高（P＜0.05），见图3。

Figure 3.Effect of traditional Chinese medicine（TCM；active components of Epimedium，Astragalus and Radix Puerariae）on ADAM10 protein expression in HT22 cells induced by Aβ.Red：AMAM10；blue：DAPI.Scale bar=20 μm.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Aβ group；△P＜0.05 vs RNAi group；▲P＜0.05 vs Aβ+RNAi group.图3 淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对Aβ诱导的HT22细胞中ADAM10蛋白表达的影响

4 Western blot和qPCR检测ADAM10的表达

Western blot结果及qPCR结果显示，与control组比较，Aβ 组、RNAi 组和Aβ+RNAi 组中的ADAM10蛋白及mRNA 表达降低（P＜0.05）；与Aβ 组比较，Aβ+RNAi 组中ADAM10 蛋白及mRNA 表达降低（P＜0.05），Aβ+TCM 组中ADAM10蛋白及mRNA 表达增高（P＜0.05）；与RNAi 组比较，Aβ+RNAi 组中的ADAM10 蛋白及mRNA 表达降低（P＜0.05），RNAi+TCM 组中的ADAM10 蛋白及mRNA 表达增高（P＜0.05）；与Aβ+RNAi 组比较，Aβ+RNAi+TCM 组中的ADAM10蛋白及mRNA表达增高（P＜0.05），见图4。

讨 论

AD 发病机制学说众多［11］，包括Aβ 级联学说、Tau蛋白学说、氧化应激学说和金属离子代谢紊乱学说等［12］。脑部出现老年斑是AD 的主要病理学标志［13］，其核心成分是一种由39～43 个氨基酸残基构成的小神经肽Aβ。AD 中Aβ 的重要形式是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ 斑块中主要的成分是Aβ1-42，它更易于聚集，有很强的神经毒性，Aβ1-40是Aβ 主要的可溶性形式，主要存在于血液循环之中。Aβ25-35被认为是Aβ1-42的活性片段，于37℃水浴箱孵育7 d 左右，即为“聚集”状态［14］。因此，在本实验中我们采用Aβ25-35诱导细胞建立AD细胞模型。

Aβ 由其前体蛋白APP 水解代谢产生，在α、β 和γ 位使APP 发生裂解的蛋白酶分别称之为α、β 和γ-分泌酶［15］，其中α-分泌酶是由整合素和金属蛋白酶家族（a disintegrin and metalloprotease，ADAM）的成员ADAM9、ADAM10 和ADAM17 组成，所有成员都有相同的结构域。ADAM10 是ADAM 家族中最早就确认具有α-分泌酶功能的蛋白酶，是APP 的非淀粉样剪切中重要的α-分泌酶。ADAM10 可以减少Aβ的形成增加其脱落，以及显著减少淀粉样蛋白的过度表达；相反，ADAM10表达的减少导致了淀粉样蛋白形成增加的机会［16］。有报道显示，中、重度AD 患者血液中ADAM10 的表达是降低的［17］。HT22 细胞是小鼠海马神经元永生化的细胞，具有神经元的形态和功能，是近年来体外研究神经退行性病变的常用细胞。本研究以Aβ25-35诱导HT22 细胞建立AD 细胞模型，研究结果显示AD 细胞模型组中ADAM10表达降低。

Figure 4.Effect of TCM on ADAM10 protein and mRNA expres⁃sion in HT22 cells induced by Aβ.A：ADAM10 pro⁃tein expression was measured by Western blot；B：ADAM10 mRNA expression was measured by qPCR.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Aβ group；△P＜0.05 vs RNAi group；▲P＜0.05 vs Aβ+RNAi group.图4 淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对Aβ 诱导的HT22细胞中ADAM10表达的影响

APP 是一种典型的金属蛋白，其5´端非翻译区（5´-untranslational region，5´-UTR）带有一个功能性的铁反应元件（iron-response element，IRE），铁离子可通过5´-UTR 调控APP mRNA 的表达。铁离子影响着APP 的表达及Aβ 的分泌和沉积［18］，AD 患者脑内Aβ 的产生与多种铁离子结合蛋白关系密切。铁代谢相关蛋白包括二价Tf、TfR1、ferritin、FPN1、Ft⁃Mt、DMT1、IRPs 和HAMP 等，其中HAMP 是近年来发现的重要的铁调节激素，是维持细胞内正常铁代谢的重要金属转运蛋白，它精确调控铁吸收、储存和释放过程［19］。HAMP 是由25 个氨基酸组成的多肽，主要在肝脏合成并成熟，随后分泌到血液中，转运到它的主要靶器官包括小肠、肝脏、骨髓细胞和巨噬细胞，控制这些器官的铁代谢活动。血液中HAMP 浓度增加，将抑制小肠上皮细胞铁吸收蛋白的表达、进而抑制小肠铁吸收，同时增加肝脏细胞，骨髓细胞和巨噬细胞对铁的摄取，进而增加铁储存和铁利用。通过这一HAMP 介导的途径，可有效缓解铁超载；反之，HAMP敲除或者浓度降低，铁的吸收会增加，而铁的储存和利用减少，造成铁超载。但其对APP 水解的影响尚未见报到。因此，本实验以HAMP 为靶点，在AD 细胞模型中使HAMP基因沉默，观察HAMP 对ADAM10 的影响。研究结果显示，沉默HAMP可抑制ADAM10 的表达，说明HAMP 可调节APP 的水解，从而影响Aβ的产生。

中医在抗痴呆方面有着丰富的临床和实践经验，中药是我国的传统瑰宝，有上千年的悠久历史，在病理治疗中以其多靶点和多效性等优点有着巨大潜力。我们前期研究观察，淫羊藿、黄芪、葛根有效组方可以有效缓解AD 模型小鼠脑组织铁超载，明显改善AD 小鼠学习记忆能力，下调AD 模型小鼠脑组织Aβ 的表达，其机制与淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以调节AD 模型小鼠脑组织FPN1、DMT1 和HAMP 等铁代谢相关蛋白的表达有关［20］，但具体机制仍然不明确。本实验在以往研究的基础上进一步研究淫羊霍、黄芪、葛根素有效成分组方干预Aβ 表达的内在机制，研究结果显示淫羊霍、黄芪、葛根素有效成分组方介导HAMP 上调AD 细胞模型AD⁃AM10的表达。

综上所述，淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可能通过调节HAMP 的表达，缓解脑细胞的铁超载，促进ADAM10 的表达，从而增强APP 的非淀粉样代谢通路，减少Aβ 沉积，这也可能是淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方防治AD 的内在机制。但本文只在细胞水平上初步探讨了淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方介导HAMP 在APP 水解中的作用情况，而成功建立HAMP基因敲除小鼠，进一步在动物水平进行验证是否对临床有意义将是今后研究的方向。