乔建新，刘熙鹏，刘 明，曹 兵

（河北北方学院附属第一医院，河北张家口 075000）

缺血性脑卒中约占脑卒中患者的80%，具有较高的致残、致死率和复发率，恢复时间长且预后不理想。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是一种存在于血液循环和脑组织之间的特殊屏障，通过调控脑内外物质交换对维持脑神经内环境稳定起到重要作用。缺血性脑卒中及实现血流再灌注后，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（in⁃terleukin-1β，IL-1β）、IL-6 等炎症因子大量释放，将破坏BBB 结构和通透性，是导致血管源性脑水肿而致残、致死的重要因素［1-3］。因此，研究以保护BBB为靶向的药物对降低脑缺血再灌注（ischemia-reper⁃fusion，I/R）损伤具有重要意义。

甲磺酸加贝酯（gabexate mesilate，GM）是一种非肽类蛋白酶抑制剂。既往有研究显示，GM 能够通过抑制氧化应激和炎症反应对大鼠I/R 损伤的肝脏和小肠具有保护作用［4-5］，但GM 对I/R 损伤的脑组织是否具有保护作用的文献报道尚不多见。尼莫地平（nimodipine，NMP）是一种钙拮抗剂，可用于预防与治疗缺血性脑血管病，也是脑I/R 相关动物实验研究常用的阳性对照药物。有研究表明，脑缺血早期给予NMP 对BBB 具有保护作用［6］。本实验通过制备脑I/R 大鼠模型，以NMP 为阳性对照药物，探讨GM 对脑I/R大鼠BBB的保护作用及其可能的机制。

材料和方法

1 实验动物

SPF 级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠180 只，7周龄，体质量（230±10）g，购自承德医学院实验动物中心提供［许可证号：SCXK（冀）2017-001］。适应性饲养1周后开展实验研究，饲养环境：温度（25±1）℃、相对湿度（60±5）%、12 h 光照黑暗交替，自由饮水进食。

2 药物与试剂

注射用GM（成都天台山制药有限公司；规格：0.1 g；批号：201906024）；注射用NMP（北京四环科宝制药有限公司；规格：2 mg；批号：190531）；伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malo⁃ndialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司）；基质金属蛋白酶2（ma⁃trix metalloproteinase-2，MMP⁃2）、MMP⁃9、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和β-actin 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RNeasy Mini 试剂盒、反转录试剂盒和OneStep RT-PCR 试剂盒（Qia⁃gen）。

3 实验方法

3.1 动物分组、给药与造模 （1）对180 只SD 大鼠进行数字编码后，按照随机数字表法随机分为6 组：假手术组（sham 组）、模型组（I/R 组）、NMP（2 mg·kg−1·d−1）组和GM（5、10 和20 mg·kg−1·d−1）组［药物剂量选择依据：根据人和大鼠药物剂量换算公式，大鼠剂量（mg/kg）=6.3X（X 为人临床剂量，单位：mg/kg），GM 人临床使用剂量为100 mg/d，按照成人体重65 kg 计算，可得：GM 大鼠剂量为9.69 mg·kg−1·d−1，因此确定10 mg·kg−1·d−1为中剂量，另设5 mg·kg−1·d−1为低剂量，20 mg·kg−1·d−1为高剂量。同理，算得NMP大鼠剂量为1.16～2.33 mg·kg−1·d−1，并参照段晋宁等［7］报道的大鼠实验剂量，确定NMP 组所用NMP剂量为2 mg·kg−1·d−1］，每组30 只。（2）精确称取GM和NMP 粉针剂加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度2.5、5和10 g/L的GM 溶液和浓度1 g/L的NMP溶液。造模前10 min，GM（5、10 和20 mg·kg−1·d−1）组腹腔注射浓度2.5、5 和10 g/L 的GM 溶液，NMP（2 mg·kg−1·d−1）组给予浓度1 g/L 的NMP 溶液，假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液，注射剂量均为2 mL/kg。（3）脑I/R 模型制备［8］：造模手术前12 h 禁食不禁水，实施麻醉后沿颈部正中切口、钝性剥离右侧颈总动脉和颈外、颈内动脉，夹闭颈总动脉并结扎颈外动脉后，由颈外动脉切口插入直径0.235 mm 的线栓进入颈内动脉，遇阻力止（深度距分叉处约18 mm），固定线栓后逐层缝合皮肤并擦拭碘伏进行消毒处理；假手术组除不在颈外动脉切口和插入线栓外，其余同模型组。再灌注6 h后行各指标检测。

3.2 Longa 评分法检测大鼠神经功能 各组随机选取10 只大鼠，参照Longa 评分标准进行评分［9］∶大鼠神态、动作正常计0 分；缺血对侧前爪不能伸展计1分；爬行时向缺血对侧转圈行走计2 分；向缺血对侧倾倒计3 分；不能爬行计4 分。Longa 评分越高则说明大鼠神经功能缺损越严重。

3.3 BBB通透性检测 参照邱珂等［10］报道的伊文思蓝渗透法检测BBB 通透性：评分完成后的各组10 只大鼠，以4 mL/kg 剂量尾静脉注射2%的伊文思蓝溶液；1 h后麻醉，实施心脏灌注300 mL 0.9%氯化钠溶液后断头、取右侧大脑；研磨匀浆后加入3 倍量甲酰胺溶液，60℃孵育24 h 后3 000 r/min 离心10 min（离心半径15 cm），取上清液；然后通过酶标仪测定610 nm 波长处的吸光度（A）。根据标准曲线计算伊文思蓝含量，脑组织伊文思蓝含量可反映BBB通透性。

3.4 脑组织含水量检测 各组随机选取10只大鼠，颈椎脱臼处死后断头取脑，去除小脑和脑干，冲洗干净并用滤纸拭干后称重，即为湿重（W1）；置于95℃烘箱24 h 后称重，即为干重（W2）。脑组织含水量（%）=（W1−W2）/W1×100%

3.5 脑组织生化指标检测 各组随机选取10 只大鼠，颈椎脱臼处死后断头取脑，切取右侧大脑组织置冰上，剪碎后加入9 倍量4℃预冷裂解液，研磨得到脑组织匀浆液。经4 500×g离心10 min 后（离心半径15 cm）取上清液，然后按照各试剂盒操作步骤，通过生化分析法检测SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量；通过ELISA 试剂盒检测TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量。

3.6 RT-PCR 法检测脑组织MMP-2、MMP-9 和NFκB 的mRNA 表达 取0.1 g 脑组织，采用RNeasy Mini 试剂盒分离纯化总RNA，通过核酸分析仪检测RNA 浓度和纯度后，遵照反转录试剂盒操作说明将RNA 逆转录成cDNA。遵照OneStep RT-PCR 试剂盒操作说明进行PCR 扩增，程序设置为：94℃15 s，55℃30 s，70 ℃30 s，共40 个循环。将PCR 产物经过琼脂糖凝胶电泳并显影、拍照。以β-actin 为内参照，半定量计算目的基因的相对表达量。所用引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used in RT-PCR

3.7 Western blot 法检测脑组织MMP-2、MMP-9 和NF-κB 蛋白表达 取脑组织匀浆液，4℃、16 000×g离心20 min 后取上清液，通过总蛋白提取试剂盒提取总蛋白、BCA 法检测总蛋白含量后，上样（20 μg 总蛋白）、行凝胶电泳（当样品指示剂到达分离胶时电压由80 V 变为120 V）、冰上转膜（电压100 V，时间1 h），5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后，滴加兔抗鼠MMP⁃2、MMP⁃9 和NF-κB 单克隆抗体，4℃过夜，TBST 溶液洗膜后滴加II 抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜后ECL显色，通过凝胶成像仪获得条带；以β-actin 为内参照，以条带灰度值半定量MMP⁃2、MMP⁃9和NF-κB蛋白表达量。

4 统计学处理

应用SPSS 17.0 软件包进行统计分析。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠神经功能测定结果

通过Longa评分检测各组大鼠神经功能，结果显示，与sham 组比较，I/R 组大鼠Longa 评分显著升高（P＜0.01）；与I/R 组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组和NMP（2 mg·kg−1·d−1）组Longa 评分显著降低（P＜0.01）；与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较，GM（20 mg·kg−1·d−1）组Longa评分显著降低（P＜0.05），见图1。

Figure 1.The nerve function of the rats in each group measured by Longa scoring method.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg−1·d−1）group.图1 各组大鼠神经功能测定结果

2 各组大鼠BBB通透性测定结果

伊文思蓝渗透实验结果显示，与sham 组比较，I/R 组大鼠BBB 通透性显著升高（P＜0.01）；与I/R 组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组和NMP（2 mg·kg−1·d−1）组BBB 通透性显著降低（P＜0.01）；与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较，GM（20 mg·kg−1·d−1）组BBB通透性显著降低（P＜0.05），见图2。

3 各组大鼠脑组织含水量测定结果

与sham 组比较，I/R 组大鼠脑组织含水量显著升高（P＜0.01）；与I/R 组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组及NMP（2 mg·kg−1·d−1）组脑组织含水量降低（P＜0.05 或P＜0.01）；GM（20 mg·kg−1·d−1）组脑组织含水量与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

4 各组大鼠脑组织氧化应激指标测定结果

与sham 组比较，I/R 组大鼠脑组织SOD 和GSHPx 活性显著降低，MDA 含量显著升高（P＜0.01）；与I/R 组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组和NMP（2 mg·kg−1·d−1）组脑组织SOD 和GSH-Px 活性显著升高，MDA 含量显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较，GM（20 mg·kg−1·d−1）组SOD 活性显著升高，MDA 含量显著降低（P＜0.05），但两组间GSH-Px活性差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

Figure 2.The BBB permeability of the rats in each group mea⁃sured by Evans blue permeation method.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg−1·d−1）group.图2 各组大鼠BBB通透性测定结果

Figure 3.The brain water content of the rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group.图3 各组大鼠脑组织含水量测定结果

5 各组大鼠脑组织炎症反应指标测定结果

与sham 组比较，I/R 组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-6 含量显著升高（P＜0.01）；与I/R 组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组和NMP（2 mg·kg−1·d−1）组TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较，GM（20 mg·kg−1·d−1）组TNF-α含量显著降低（P＜0.05），但两组间IL-1β 和IL-6 含量差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

Figure 4.Determination results of oxidative stress indexes in brain tissue of the rats in each group.A：the activity of SOD；B：the ac⁃tivity of GSH-Px；C：the content of MDA.Mean±SD. n=10.**P＜0.01vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg−1·d−1）group.图4 各组大鼠脑组织氧化应激指标测定结果

Figure 5.Measurement results of inflammatory response indexes in brain tissue of the rats in each group.A：the content of TNF-α；B：the content of IL-1β；C：the content of IL-6.Mean±SD. n=10.**P＜0.01vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg−1·d−1）group.图5 各组大鼠脑组织炎症反应指标测定结果

6 各组大鼠脑组织MMP-2、MMP-9 和NF-κB 的mRNA表达检测结果

与sham 组比较，I/R 组大鼠脑组织MMP⁃2、MMP⁃9和NF-κB 的mRNA 表达上调（P＜0.01）；与I/R 组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组和NMP（2 mg·kg−1·d−1）组MMP⁃2、MMP⁃9 和NF-κB mRNA 表达下调（P＜0.01）；与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较，GM（20 mg·kg−1·d−1）组MMP⁃2、MMP⁃9和NF-κB 的mRNA 表达下调（P＜0.01），见图6。

7 各组大鼠脑组织MMP-2、MMP-9和NF-κB 蛋白表达检测结果

与sham 组比较，I/R 组大鼠脑组织MMP-2、MMP-9和NF-κB蛋白表达上调（P＜0.01）；与I/R组比较，GM（10 和20 mg·kg−1·d−1）组和NMP（2 mg·kg−1·d−1）组MMP⁃2、MMP⁃9 和NF-κB 蛋白表达下调（P＜0.05 或P＜0.01）；与NMP（2 mg·kg−1·d−1）组比较，GM（20 mg·kg−1·d−1）组MMP⁃2、MMP⁃9和NF-κB蛋白表达下调（P＜0.05或P＜0.01），见图7。

讨 论

BBB 是以内皮细胞为核心并依靠星形胶质细胞、神经元、周细胞、小胶质细胞等提供结构和功能支持，在细胞间辅以紧密连接蛋白复合体（tight junc⁃tion protein systerm，TJPs）而形成的生理性屏障［11］，能够阻止有害物质由血液进入脑组织，从而保证脑组织稳态。其中，TJPs 由跨膜蛋白、胞质附着蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用形成，对维持BBB 结构和功能至关重要［12］。

Figure 6.The mRNA expression levels of MMP⁃2，MMP⁃9 and NF-κB in brain tissue of the rats in each group detected by RT-PCR.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；##P＜0.01 vs NMP（2 mg·kg−1·d−1）group.图6 RT-PCR检测各组大鼠脑组织MMP⁃2、MMP⁃9和NF-κB的mRNA表达水平

Figure 7.The protein expression levels of MMP⁃2，MMP⁃9 and NF-κB in brain tissue of the rats in each group detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NMP（2 mg·kg−1·d−1）group.图7 Western blot检测各组大鼠脑组织MMP⁃2、MMP⁃9和NF-κB蛋白表达水平

缺血性脑卒中及实现再灌注后，缺血区线粒体能量代谢障碍、呼吸链受阻而诱发ROS 大量产生以及炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 大量释放［13-14］，导致以ROS 为底物的抗氧化酶SOD 和GSH-Px 被过度消耗，使机体ROS 代谢失衡而过剩蓄积，攻击核酸、蛋白等大分子物质生成具有毒性的MDA［15］。此外，Wang等［16］的研究显示，ROS攻击细胞膜而破坏细胞骨架，降解跨膜蛋白和胞质附着蛋白而破坏TJPs，从而破坏BBB 结构；He 等［17］和陆正齐［18］的研究表明，炎症因子TNF-α 和IL-1β 能够刺激中性粒细胞等进一步产生和释放炎症因子，从而诱发炎症级联反应；炎症反应能够导致TJPs 结构损坏，并且TNF-α 和IL-1β 能够活化NF-κB 而诱导内皮细胞黏附分子［细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）等］上调表达，进而增加BBB 通透性；IL-6 则能够刺激ROS 大量释放，从而加重ROS所造成的损伤。闫磊等［19］的研究显示，通过给药抑制脑I/R 大鼠炎症反应和氧化应激损伤，能够降低BBB 通透性并减轻脑缺血再灌注损伤；何平平等［20］的研究表明，通过药物干预保护脑I/R大鼠TJPs结构能够有效降低BBB 通透性并缓解脑水肿，减轻脑缺血再灌注损伤。本实验结果显示，GM 干预能够有效降低脑I/R 大鼠神经功能Longa 评分，抑制氧化应激损伤和炎症反应，下调NF-κB 转录与表达，降低BBB 通透性，减轻脑水肿，并且20 mg·kg−1·d−1剂量的GM 对神经功能和BBB 通透性的保护作用及对氧化应激指标、炎症因子、NF-κB 转录与表达的调控作用均优于NMP，提示GM 可能通过抑制氧化应激损伤和炎症反应对脑I/R 大鼠BBB 和神经功能起到保护作用。

细胞外基质也是BBB 的重要组成部分，MMP 在催化降解细胞外基质以维持其合成-消化降解平衡中起着关键作用，并且MMP⁃2 和MMP⁃9 能够消化降解跨膜蛋白和内皮细胞基底层而破坏BBB 结构［21］。刘菡等［22］和宋俊科等［23］的研究通过药物干预下调MMP⁃2和MMP⁃9表达能够保护脑I/R大鼠BBB，进而减轻脑缺血再灌注损伤。本实验结果显示，GM 干预能够有效抑制脑I/R 大鼠脑组织MMP⁃2 和MMP⁃9的mRNA 及蛋白表达上调，并且20 mg·kg−1·d−1剂量的GM 对MMP⁃2和MMP⁃9 mRNA 及蛋白表达的调控作用优于NMP。这可能是GM 保护脑I/R 大鼠BBB的另一机制。

综上所述，本研究证实了GM 对脑I/R 大鼠BBB和神经功能具有保护作用，其潜在机制可能是抑制氧化应激和炎症反应以及下调MMP⁃2、MMP⁃9 和NF-κB 蛋白表达。本研究为GM 作为脑I/R 损伤防治药物提供了实验依据。