冯智，张小博，惠慧

(中国药科大学玄武门校区，江苏省肿瘤发生与干预重点实验室，江苏 南京 210009)

0 引言

Rho小G蛋白属于Ras超家族中的一员，具有GTP酶活性，它的分子开关作用，是通过在活化态(结合GTP)和非活化态(结合GDP)之间转换来实现的，在细胞内是一种重要的信号转导分子。Rho蛋白通过结合其下游靶效应分子，进而产生多种生物学效应，其中最重要的效应分子之一是Rho相关蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinases,ROCK)，其属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量约为160 kD。ROCK具有许多功能，其中包括调节细胞收缩，迁移，粘附和增殖。药理研究发现，诸如多发性硬化症[1]，炎症性疾病[2]，心肌缺血[3]，高血压[4]等各种疾病的发生与ROCK有关。同时研究还发现，ROCK蛋白的异常表达与肿瘤有着密切的联系。本文主要论述了ROCK蛋白及其抑制剂在肿瘤发生发展中所起作用的研究进展，以期为新的药物相关治疗靶点的发现提供线索。

1 ROCK蛋白的结构特点及其活性调节

自上世纪90年代后半叶发现[5]以来，ROCK逐渐成为功能研究最详细的Rho下游靶效应分子，其在细胞内存在有两种在同源性上相似度较高的异构体，即ROCK1(ROKβ或p160 ROCK)与ROCK2(ROKα)。ROCK遍布全身，相比之下，ROCK1在肝，肺，脾和睾丸等非神经组织中富集，而ROCK2在脑，心脏和肌肉等组织中中则呈现更高的表达量[6]。下面分别论述二者的结构特点及其活性调节。

1.1 ROCK蛋白的结构特点

在人类中，ROCK1和ROCK2都包含33个外显子，二者分别位于18号染色体(18q11.1)和2号染色体(2p24)上。ROCK1开放阅读框编码1354个氨基酸，而ROCK2编码1388个氨基酸。ROCK1和ROCK2在它们的一级氨基酸序列中具有64%的同一性，并且在激酶域中具有高度相似性(共有92%)[7]。ROCK氨基酸序列由一个激酶结构域(RBD)(氨基末端)，一个卷曲螺旋区域，一个PH结构域(PHD)和一个富含半胱氨酸的结构域(CRD)(羧基末端)组成，其中Rho结合域(RBD)在螺旋结构域中。

1.2 ROCK蛋白的活性调节

尽管ROCK1和ROCK2具有高度相关的功能结构域和显著的氨基酸同一性，但它们可以通过相同的常见方式以及ROCK1或ROCK2独有的机制来进行活性的调节。

首先，一方面无论是ROCK1或ROCK2，它们的羧基末端区域都起自抑制区的作用。当该部分的缺失后，会导致体内和体外激酶活性的激活[8]。抑制的发生可能是因为激酶域的活性位点被相互作用所阻断[9]。Ras超家族包括Rho-GTPase蛋白RhoA和RhoC，它们是最典型的ROCK调节剂。据报道，Rho蛋白结合GTP被激活后，再与RBD的相互作用可通过诱导构象变化来破坏激酶结构域与自抑制羧基末端区域之间的负调节相互作用，从而提高激酶的活性。虽然Rho蛋白通常激活ROCK，但其他GTP结合蛋白已被发现负调控ROCK信号。在RBD附近的卷曲区，Gem与ROCK1相互作用，从而抑制MLC的磷酸化和MLC磷酸酶的MYPT1亚基[10]。另一种小的GTP结合蛋白Rad1也被报道模拟Gem通过阻断ROCK2来抑制肌球蛋白的收缩性，导致细胞突起的减少。

其次，另一方面ROCK1和ROCK2则会通过各自独有的机制来进行调节。例如，在细胞凋亡的情况下，ROCK1通过半胱天冬酶的裂解和去除自抑制域而被激活[11]，而ROCK2则可能被颗粒酶B(Granzymes B)介导的裂解激活，这也导致了胱天蛋白酶的激活[12]。这两个事件均导致不依赖Rho的组成型活性激酶片段的产生，从而导致肌动蛋白-肌球蛋白的收缩不受约束，进而导致膜起泡，凋亡小体形成以及核材料包装成小泡和凋亡小体[13]。在负调控方面，磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(Phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK1)与RhoE类似的ROCK1区域竞争结合，从而对抗RhoE对ROCK1的负调控[14]；而通过与PH结构域的直接结合，肌动蛋白结合蛋白1B(Coroninactin binding protein 1B，CORO1B)则会对ROCK2信号通路进行抑制[15]。

2 ROCK蛋白与肿瘤的关系

ROCK是癌症进展过程中的关键角色。ROCK及其下游靶点主要参与调节肌动蛋白的细胞骨架动力学，因此负责细胞迁移和运动。此外，它们还与多种生物学过程有关，例如细胞连接完整性，细胞周期控制和细胞凋亡。它们在癌症进展各种过程中的作用，例如肿瘤细胞存活与凋亡[16]，侵袭转移[17]，以及血管增生[18]等都已得到证明。尽管通常认为ROCK激活是致癌的，但一些研究表明ROCK在癌症进展中起负调控作用。因此，ROCK在不同类型癌症过程中的确切作用，具体取决于细胞类型和肿瘤周围的微环境。

2.1 ROCK蛋白在肿瘤细胞存活和凋亡中的作用

ROCK在肿瘤细胞存活和凋亡中有时会呈现出不一样的作用。研究表明，在一些类型的肿瘤细胞中，ROCK蛋白表现出促进肿瘤细胞存活的效应，即ROCK受到激活可增加细胞活力，ROCK受到抑制可诱导细胞凋亡。Ming-KeQiu[19]等通过对婴儿期发生的血管瘤(HA)进行研究，发现与增殖期HA相比，ROCK和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的蛋白质与mRNA积累会显著更高。增殖期HA中细胞凋亡指数低，而渐入期HA中细胞凋亡指数增加。用ROCK抑制剂Y-27632处理后发现，Y-27632诱导HA细胞中p53表达并下调VEGF表达，显著地抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

相比之下，其他研究表明，ROCK的抑制作用可促进肿瘤细胞存活和化学抗药性，或降低抗癌剂的凋亡作用。这是因为，ROCK有助于肌球蛋白轻链的磷酸化，肌球蛋白ATPase活性和肌动蛋白-肌球蛋白丝与质膜的偶联，在细胞凋亡过程中被裂解以产生截短的活性形式。ROCK蛋白的活性对于形成膜泡以及将片段化的DNA重新定位到膜泡和凋亡小体中都是必需的和足够的。例如，Hong Zhou[20]等通过对高葡萄糖(HG)诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激过程进行研究，证明了RhoA / ROCK通路通过氧化应激以及p38MAPK和JNK在新生大鼠中的活化介导HG诱导的心肌细胞凋亡。而使用ROCK的抑制剂法舒地尔通过减轻氧化应激以及调节Bax /Bcl-2表达并抑制caspase-3裂解的p38MAPK和JNK途径来防止HG诱导的心肌细胞凋亡。

从这些研究可以得出的结论是，ROCK对肿瘤细胞的促凋亡或抗凋亡作用取决于具体的细胞固有特性和外部条件。

2.2 ROCK蛋白在肿瘤细胞侵袭和转移中的作用

肿瘤细胞的侵袭是转移的标志，这是一个复杂的过程，涉及细胞骨架重组，片状脂蛋白形成，膜起皱和细胞形态变化。肌动蛋白细胞骨架的调节在细胞迁移中起重要作用，ROCK信号传导是肌动蛋白重组的主要调节因子，因为各种细胞骨架调节蛋白都是ROCK的底物。这些调节蛋白包括含有LIM结构域激酶(LIM domain kinase，LIMK)，肌球蛋白轻链(Myosin Light Chain，MLC)和MLC磷酸酶。ROCK活化的LIMK使纤溶蛋白(Cofilin)磷酸化并使其肌动蛋白解聚活性失活，从而导致肌动蛋白丝的稳定性[21]。另一方面，ROCK通过MLC磷酸酶的磷酸化和失活或MLC的直接磷酸化来促进MLC的磷酸化，从而导致肌球蛋白活化和肌动蛋白驱动产生收缩力[22]。

大多数研究都赞成ROCK激活通过对肿瘤细胞运动的直接影响，或对癌症相关的成纤维细胞的间接作用来增强肿瘤细胞的侵袭和转移，从而增加细胞外基质的硬度并促进癌细胞的移动。例如在乳腺癌骨转移的小鼠模型中，ROCK通过调节细胞骨架肌动蛋白-肌球蛋白的收缩和调节c-Myc途径，增加了细胞的运动性，促进了侵袭和转移[23]。作为一种高度浸润性的癌症，晚期卵巢癌的不良预后来自人类卵巢癌细胞侵袭性的增强。而在这其中，溶血磷脂酸(LPA)/ Rho /ROCK通路与卵巢癌的发展过程密切相关，当ROCK受到抑制时，会显著降低LPA诱导的人卵巢癌细胞的侵袭和运动，进而减弱了人卵巢癌细胞的侵袭性[24]。

2.3 ROCK蛋白在内皮细胞增殖与血管生成中的作用

与在肿瘤细胞侵袭和转移中的活性相似，大多数研究都表明ROCK能够调节细胞增殖和血管生成而在肿瘤生长中发挥积极作用。这主要是通过影响VEGF介导血管生成、静脉通透性和新生血管[25]等重要作用来实现的。

大量报道表明，ROCK抑制作用会降低肿瘤细胞的增殖和血管生成[26]。例如，通过在促进应激纤维形成方面的公认作用，ROCK促进了纤连蛋白基质的组装，细胞粘附以及转移性肾肿瘤细胞的增殖[27]。在肺癌中，使用法舒地尔进行治疗会抑制肺癌细胞的生长[28]。由于它通过引起应力纤维断裂而抑制了肺癌条件下的内皮细胞增殖和体内侵袭能力，因此它也显着减弱了血管生成[29]。此外，ROCK抑制作用还可以通过阻止癌基因的激活来减少肿瘤细胞的增殖。ROCK在T58和/或S62处使癌基因c-Myc磷酸化，从而确保c-Myc在乳腺癌[30]和前列腺癌[31]中具有更高的稳定性和转录活性；因此，ROCK的抑制降低了c-Myc活性。

相反，在其他研究中，还发现ROCK抑制作用可增加细胞增殖。例如，在结肠癌[32]和胰腺癌细胞[33]中，用Y-27632处理可诱导细胞增殖。这些研究表明，ROCK负调节EGF诱导的细胞增殖，而EGF首先刺激EGF受体的激活并随后增加癌细胞的增殖，EGF同时诱导ROCK的激活，然后关闭ROCK。通过负反馈系统激活EGF受体途径。因此，用Y-27632抑制ROCK可以防止负反馈，从而导致EGF活性增加和细胞增殖。此外，据报道，ROCK抑制通过下调抑癌基因，磷脂酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)来促进细胞增殖，从而导致Akt磷酸化上调，这对于细胞增殖和存活至关重要[34]。

综上所述，ROCK通过促进肌动球蛋白细胞骨架的收缩性以及细胞粘附，胞质分裂和癌基因的激活，在许多细胞类型的癌细胞增殖中具有普遍的积极作用。尽管在特殊情况下，通过对生长因子信号传导(例如EGF)和促进肿瘤抑制基因激活(例如PTEN)的负面反馈，存在一些例外情况。

3 ROCK抑制剂与肿瘤的关系

3.1 ROCK抑制剂的分类及应用

现已研究的ROCK抑制剂按其所发挥作用的靶标主要可以分为两大类：针对所有ROCK非选择性抑制剂,以及只对一种或几种ROCK同工型的选择性抑制剂。而它们的共同点则几乎都是ATP竞争性抑制剂，主要代表有Y27632、法舒地尔、羟基法舒地尔和H-1152P。目前通过针对这四种抑制剂及对ROCK1配合物晶体结构的解析来开发高度选择性和更有效的抑制剂。

最近也有越来越多新的高效选择性抑制剂被报道，例如主要针对ROCK1的抑制剂MBPTA，是一种苯并呋喃衍生物，在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中显示出神经保护作用[35]。而另一种主要针对ROCK2的抑制剂Compound 24在人卵巢癌细胞系SKOV-3中，可以通过激活外源性死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡[36]。随着研究的深入，新型ROCK抑制剂已逐渐用于研究非癌性疾病的治疗。同样是主要针对ROCK2的抑制剂，KD025(以前称为SLx-2119)通过ROCK2依赖性机制部分抑制3T3-L1细胞的脂肪生成，除脂肪生成因子FABP4和Glut4外，KD025下调了脂肪形成过程中关键的脂肪形成转录因子PPARγ和C /EBPα的表达，因此KD025有望成为抗脂肪形成或肥胖症药物[37]。在其他的研究报道中，作为ROCK的抑制剂，DL0805及其衍生物在缺氧的条件下对肺动脉血管细胞，包括人肺动脉内皮细胞(HPAEC)和人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)具有保护作用[38]。

3.2 RCOK抑制剂与其他抗癌疗法的联用

随着研究的深入，除了以往的单独使用ROCK抑制剂来治疗癌症，越来越的研究开始探讨将ROCK抑制剂与其他抗癌疗法联用的效果。最近的一项实验表明，在人类非典型慢性粒细胞白血病(aCML)细胞中，Y27632和法舒地尔增加了酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的抗增殖和促凋亡作用[39]。同样的，ROCK抑制剂与MEK或ERK抑制剂可以联合用于NRAS突变性黑色素瘤的治疗。当将ROCK抑制剂添加MEK抑制剂中来进行治疗时，可以使得MEK抑制剂的剂量显著降低。这有利于减缓MEK抑制剂所存在的严重剂量依赖的靶点毒性，避免了MEK抑制剂迫使黑素瘤患者停止治疗或降低剂量[40]。

但是，在某些情况下，将ROCK抑制与化学治疗剂联合使用可能导致增强的肿瘤化学耐药性。例如，Y27632在成神经细胞瘤细胞中对ROCK的抑制作用导致顺铂细胞毒性后肿瘤存活率提高[41]。因此，在开发联用ROCK抑制剂的新型抗癌疗法时，应考虑并应排除ROCK抑制剂可能的有害作用。

4 总结与展望

ROCK蛋白对许多细胞骨架相关蛋白的调节具有主要影响，从而有助于实现广泛的细胞功能。近年来越来越多的证据表明，ROCK信号至少在许多重要的癌症相关表型中起着至关重要的作用。靶向ROCK信号的研究越来越体现在癌症治疗中，特别是在抑制肿瘤细胞的侵袭、转移，肿瘤生长，血管生成，与癌症相关的细胞外基质改变和血液系统恶性肿瘤中。尽管ROCK抑制剂法舒地尔已经在临床上应用了20年，但目前尚未用于癌症治疗，并且涉及人类癌症的临床试验数量仍然有限。

将逐渐发现的ROCK信号通路新的作用转化为抗癌治疗的效果，仍存在许多挑战。当前有关ROCK信号在肿瘤发生发展中所起作用的信息尚不完善，尤其是ROCK在调节包括原发性肿瘤细胞在内的肿瘤细胞，包括它们的迁移、增殖、凋亡、存活等方面的促进或抑制作用的机制仍然不清楚。然而，逐渐为人们所知的是，ROCK下游信号传导可能在很大程度上取决于肿瘤细胞的类型和微环境。最近已经开发出了更多的有效和选择性的ROCK抑制剂，其中一些可能在不久的将来在癌症治疗中显示出广阔的前景。同时值得注意的是，不少ROCK抑制剂与其他抗癌药的联合治疗产生了更显著的抗癌作用，并且降低了对单一药剂的耐药性。我们还需要更深入地研究癌症的发病机制，以及ROCK1及其抑制剂与肿瘤的关系，以期为癌症的治疗提供更多可行的办法。