王晓江(综述)，廖之君，林德馨(审校)

(福建医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，福州350004)

结构域是蛋白质结构和功能的基本组成单位。除少量无序化蛋白质外，绝大部分蛋白质是由一个或多个结构域组成的。根据结构分类数据库定义，结构域可以独立地复制和折叠。通过研究物种中结构域的分配情况，发现有1235个不同的结构域，由于结构域是物种进化的单元，在不同复杂物种中结构域数目差别很小，大约有34%的结构域被大部分物种共享，这些结构域大部分参与了转录、翻译和新陈代谢的途径［1］。DEP 结构域(dishevelled，Egl-10 and pleckstrin domain)是一个高度保守的结构域，并且在人类的一些疾病相关蛋白的功能研究中涉及到此结构域，为了进一步探讨它的生物学作用，现就DEP结构域的功能进行综述。

1 DEP结构域的结构组成分析

DEP结构域是一个由接近100个氨基酸组成的蛋白模序。通过序列比对和基因树重建发现有6个亚家族存在。人类基因组中至少有67种基因编码该结构域。它有H1、H2、H3三个α螺旋构成其核心结构。在鼠的Epac和人的Pleckstrin的DEP结构域中都含有这种保守的核心区域。其中H1、H2被β发卡结构隔开，H3在两个β的后面。三个螺旋结构形成了一个疏水性的核心。通过疏水性的作用力来稳定DEP结构域［2］。通过磁共振光谱学分析DEP结构域的功能，其中α螺旋与G蛋白信号调节有关，在Pleckstrin蛋白中的DEP结构域被PH结构域(pleckstrin homologous domain)包围，通过结构分析和互补性分析发现DEP结构与PH结构域的N端相互作用［3］。

2 DEP结构域的细胞膜锚定功能

DEP结构域能够通过不同机制与膜结合。许多蛋白中含有DEP高度同源的结构域，比如:Dishevelled(Dvl)、Epac1、Epac2、G 蛋白信号调节蛋白(regulator of G protein signaling，RGS)、Sst2 和哺乳动物中RGS 蛋白 R7 亚家族［4］(RGS6、7、9、11)。其中，Dvl蛋白中的DEP结构域功能研究最早，它包括三个保守的结构域:DIX(Dis/Axin homologous domain)、PDZ(PSD-95 and ZO-1 domain)、DEP，Dvl蛋白是细胞中的一个非常重要的调节蛋白。N末端DIX结构域主要跟经典的Wnt/β-catenin信号通路有关，PDZ与胞质面Wnt蛋白受体Fz的尾部结合，DEP参与Dvl蛋白由胞质到胞膜的锚定。并且和非经典的细胞极性(noncanonical planar cell polarity，PCP)信号通路有关［5］。经典的Wnt/β-catenin信号通路活化需要Dvl蛋白多聚化，连同Fz的共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白6一起形成一个超级复合体——Wnt-Fz-低密度脂蛋白受体相关蛋白6-Dvl。通过Fz的C末端结合PDZ结构域亲和力比较弱［6］，需要DEP结构域的协助作用。因此，DEP结构域对于形成经典的Wnt/β-catenin信号通路和非经典的PCP通路都发挥重要作用。

2.1 静电吸引 募集Dvl蛋白的过程最初是依靠一种静电吸引作用。DEP结构域在保守位点处有赖氨酸和酪氨酸。另外临近于C末端还有5个酪氨酸，它们被磷酸化后带正电荷，而胞质内侧面带负电荷，这种细胞内的相互作用对胞内的pH值比较敏感，主要受细胞内Na+/H+交换体Nhe2的影响［7］。当pH值降低时，膜表面的负电荷减少，会使Dvl蛋白的附着困难。同样的当DEP结构域聚集着大量酸性氨基酸时也会对质膜产生排斥反应。

2.2 假设蛋白模体介导 另一种细胞膜锚定方式是通过假设蛋白模体的介导作用与细胞膜的结合。DEP结构域与假设蛋白模体都能与细胞膜上的网格蛋白配体2蛋白(clathrin adaptor protein 2，AP-2)的亚基μ2有微弱的结合力，并且假设蛋白与富含酪氨酸的DEP结构域结合。AP-2是由 α、β2、σ2、μ2四个亚基组成。DEP结构域通过假设蛋白模体的介导作用，与μ2亚单位的C末端结合［8］。DEP结构域与μ2细长的C末端结合处呈沟槽样结构，而假设蛋白模体会在与DEP结合后将μ2亚单位表面的沟槽封闭，这样会使DEP与μ2的结合更加牢固。AP-2配体在开放(有活性)和关闭(无活性)形态中不断转化。Wnt信号通过Fz和Dvl蛋白激活磷脂酰肌醇4激酶和磷脂酰肌醇5激酶的活性，产生大量磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，通过 α、β2、μ2 亚基使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸富集在膜上，并通过磷脂酰肌醇4，5-二磷酸磷酸化μ2连接区域，使其处于活化状态。假设蛋白模体只能在AP-2配体开放状态下结合，而在关闭状态下，DEP结构域虽然具有较低的亲和力，但然可以维持与AP-2的结合［9］。在Wnt信号通路激活的情况下，通过网格蛋白介导对Fz和Dvl蛋白的内吞，激活PCP信号通路。在开放状态下，该复合体的结合更加牢固，因而能够确保内吞作用的发生［10］。

3 DEP结构域的信号转导功能

3.1 Dvl蛋白 Dvl蛋白中DEP结构域的C末端可以与G蛋白的βγ亚单位结合，随后会激活磷脂酶C、Ca2+和蛋白激酶C信号途径，破坏Dvl蛋白的空间结构，最终导致 Dvl蛋白降解，关闭 Wnt信号通路［11］。

3.2 T细胞因子4 T细胞因子4(T cell factor 4，TCF4)/β-catenin 复合体是典型的 Wnt/β-catenin 信号通路的关键分子，Wong等［12］报道Dvl-DEP结构域能够阻止Wnt蛋白诱导的TCF4基因的表达。通过磁共振结构分析发现，DEP的C末端还可以抑制TCF4基因的活性，并激活 JNK信号通路［13］。鼠蓬乱蛋白DEP结构域相互作用蛋白也称为Spats1，是一种新的蛋白，能够与Dvl-DEP蛋白相互作用，调节Wnt信号［14］。有证据表明，鼠蓬乱蛋白DEP结构域相互作用蛋白能够抑制被Wnt1、Dvl2或β-catenin蛋白所激活的Lef-1荧光报告的强度，通过蛋白酶体复合物途径，促进TCF4的降解，阻断TCF4与β-catenin的结合。以上结果显示，DEP结构域在Wnt信号通路中同时介导负性调节。

3.3 RGS 7家族蛋白 RGS 7家族蛋白包括DEP、GGL和DHEX三个结构域，与Gβ亚单位相互作用形成Gβ5-RGS7复合体［15］，阻止 Ca2+内流引起的毒蕈碱三类受体活化。毒蕈碱三类受体第一和第二个环都非常短而且高度保守，第三个环很长，而且具有多样性。DEP结构域可以直接结合到毒蕈碱三类的第三个环上，位于第345～390个氨基酸位点。单独的DEP结构域能够抑制毒蕈碱三类受体活化，并且删除DEP结构域后，Gβ5-RGS7复合体失去对毒蕈碱三类的抑制作用［16］。

4 DEP结构域调节小分子GTP酶和下游因子的功能

4.1 G蛋白 DEP结构域出现在大量的信号分子中(包括RGS)，它能够与膜上突出的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性的融合蛋白附着蛋白受体家族蛋白结合，使蛋白定位于膜上发挥活性作用。RGS蛋白通过DEP结构域介导与G蛋白受体蛋白C末端结合，使RGS蛋白停靠于接近G蛋白亚单位的位置［17］。通过调节G蛋白亚单位尿苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTP)的活性调节信号转导。

4.2 Epac1 Epac1是环腺苷酸依赖性的鸟嘌呤交换因子，具有1个或2个环腺苷酸结合位点、一个DEP结构域和GEF催化位点。通过与环腺苷酸结合和分离诱导Epac1发生活化与失活的转变。当DEP结构域发生缺失突变，会使Epac1完全丧失膜定位功能。如果Epac1中DEP结构域第82位精氨酸突变，也会使环腺苷酸诱导的Epac1活性功能丧失［18］。进一步说明了DEP结构域在Epac1活化过程中发挥着重要作用。

4.3 LRRK2与 Dvl1～3 LRRK2与 Dvl1～3对于轴突和突触的建立非常重要。编码富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因发生突变会导致帕金森病。LRRK2复杂Ras蛋白复合体-复杂Ras蛋白复合体C末端结构域能抑制GTP酶的活性，控制 LRRK2激酶的活性。而 Dvls与LRRK2Ras复杂蛋白C末端结构域的结构相似，也能够与小 GTP酶结合并调节 GTP酶的活性［19］。LRRK2与Dvl共表达能够增加LRRK2稳定期蛋白水平，这种作用依赖于DEP结构域的功能。

5 DEP结构域促进细胞极性确立的功能

DEP结构域在PCP信号通路中是必需的。PCP信号通路是一条非经典Wnt信号通路。近年来相关研究表明［20］，可以调控细胞极性排列，完成细胞形态发生(如上皮细胞)的细胞极性的确立以及在胚胎形成过程中参与原肠胚/神经胚期会聚延伸运动，参与调控神经管闭合过程。通过构建包含DEP的结构域(但不含催化位点的小分蛋白)来研究DEP结构域的功能，发现单独的DEP结构域有利于纺锤体极性的确定，甚至优于Dvl蛋白本身。提示DEP结构域能够促使纺锤体正确形成，Dvl蛋白通过细胞内或细胞间的信号限制了DEP结构域的作用［21］。

6 展望

结构域是蛋白结构和功能的基本单位决定着蛋白质的功能。DEP结构域的功能与细胞膜的锚定、信号转导、小分子GTP酶活性的调节以及细胞极性的确立等密切相关。并且从生物大分子的结构分析，取得了对细胞功能活动更深入的认识。但是，目前对DEP结构域还存在一些问题没有解答。从基因组学及蛋白质组学上进一步研究将会有重大意义。①从“定性”及“定量”角度分析。由于基因表达的时空特异性，DEP结构域表达是否会选择性的在某些组织中表达，或者在不同的组织中表达的量存在差异。通过对结构域进行全面的分析，有助于全面认识组织特异性的蛋白质特征及其结构基础。②根据DEP结构域特点构建新型融合蛋白。有望发现具有重大功能的蛋白质或结构域。从结构域结构、功能等方面着手研究，为解释生物个体发生、发展机理提供了新的视野。

［1］Ackley BD，Kang SH，Crew JR，et al.The basement membrane components nidogen and type XⅧcollagen regulate organization of neuromuscular junction in Caenorhabditis elegans［J］.J Neurosci，2003，23(9):3577-3587.

［2］Colins AT，Berry PA，Hyde C，et al.Prospective identification of tumorigenic prostate carcinoma stemcells［J］.Carcinoma Res，2005，65(23):10946-10951.

［3］Civera C，Simon B，Stier G，et al.Structure and dynamics of the human pleckstrin DEP domain:distinct molecular features of a novel DEP domain subfamily［J］.Protein，2005，58(2):354-366.

［4］Chen S，Hamm HE.DEP domains:more than just membrane anchors［J］.Dev Cell，2006，11(4):436-438.

［5］Simons M，Gault WJ，Gotthardt D，et al.Electrochemical cues regulate assembly of the Frizzled/Dishevelled complex at the plasma membrane during planar epithelial polarization［J］.Nat Cell Biol，2009，11(3):286-294.

［6］Wong HC，Bourdelas A，Krauss A，et al.Direct binding of the PDZ domain of Dishevelled to a conserved internalsequence in the C-terminal region of Frizzled［J］.Mol Cell，2003，12(5):1251-1260.

［7］Jackson LP，Kelly BT，McCoy AJ，et al.A large-scale conformational change couples membrane recruitment to cargo binding in the AP2 clathrin adaptor complex［J］.Cell，2010，141(7):1220-1229.

［8］Nishita M，Itsukushima S，Nomachi A，et al.Ror2/Frizzled complex mediates Wnt5a-induced AP-1 activation by regulating Dishevelled polymerization［J］.Mol Cell Biol，2010，30(14):3610-3619.

［9］Yu A，Xing Y，Harrison SC，et al.Structural analysis of the interaction between Dishevelled 2 and clathrin AP-2 adaptor，a critical step in noncanonical Wnt signaling［J］.Structure，2010，18(10):1311-1320.

［10］Wu J，Mlodzik M.The frizzled extracellular domain is a ligand for Van Gogh/Stbm during nonautonomous planar cell polarity signaling［J］.Dev Cell，2008，15(3):462-469.

［11］MacDonald BT，Tamai K，He X.Wnt/beta-catenin signaling:components，mechanisms，and diseases［J］.Dev Cell，2009 7，17(1):9-26.

［12］Wong HC，Mao J，Nguyen JT，et al.Structural basis of the recognition of the dishevelled DEP domain in the Wnt signaling pathway［J］.Nat Cell Biol，2000，7(12):1178-1184.

［13］Phillips BT，Kimble J.A new look at TCF and beta-catenin through the lens of a divergent C elegans Wnt pathway［J］.Dev Cell，2009，17(1):27-34.

［14］Capoano CA，Wettstein R，Kun A，et al.Spats 1(Srsp1)is differentially expressed during testis development of the rat［J］.Gene Expr Pattern，2010，10(1):1-8.

［15］Cao Y，Song H，Okawa H，et al.Targeting of RGS7/Gbeta5 to the dendritic tips of ON-bipolar cells is independent of its association with membrane anchor R7BP［J］.Neurosci，2008，28(41):10443-10449.

［16］Abramow-Newerly M，Roy AA，Nunn C.RGS proteins have a signalling complex interactions between RGS proteins and GPCRs，effectors，and auxiliary proteins［J］.Cell Signal，2006，18(5):579-591.

［17］Ballon DR，Flanary PL，Gladue DP，et al.DEP-domain-mediated regulation of GPCR signaling responses［J］.Cell，2006，12(6):1079-1093.

［18］Morel E，Marcantoni A，Gastineau M，et al.cAMP-binding protein Epac induces cardiomyocyte hypertrophy［J］.Circ Res，2005，97(12):1296-1304.

［19］Sanch RM，Law BM，Harvey K.Mutations in the LRRK2 ROCCOR tandem domain link Parkinson's disease to Wnt signaling pathway［J］.Hum Moi Genet，2009，18(20):3955-3968.

［20］Seifert JR，Mlodzik M.Frizzled/PCP signalling:a conserved mechanism regulating cell polarity and directed motility［J］.Nature Rev Genet，2007，8(2):126-138.

［21］Siller KH，Doe CQ.Spindle orientation during asymmetric cell division［J］.Nat Cell Biol，2009，11(4):365-374.