白艳苹，侯艳茹，侯普馨，孙 冰，赵丽华，巴吉木色，靳 烨，苏 琳,*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.乌拉特中旗农牧和科技局，内蒙古 乌拉特中旗 015300）

骨骼肌由具有不同收缩与代谢特性的肌纤维组成，肌纤维类型的差异会导致骨骼肌生理与代谢特征上的差异，进而引起肉品质的差异。动物骨骼肌肌纤维的组成并不是固定不变的，它们会随着骨骼肌对代谢与功能需求的改变而发生转化，且这种转化易受到营养、运动和激素等多种因素的影响，是一个非常复杂的调控过程。作为调控骨骼肌纤维类型的新介质，线粒体生物发生与肌纤维的氧化能力密切相关，在骨骼肌纤维的转化和生长发育中发挥重要作用。相关研究已经表明，乳酸菌可通过诱导线粒体生物发生中关键基因的表达、上调线粒体基因的转录水平、参与多种信号通路从而调控线粒体生物发生[1-2]。因此本文旨在阐述乳酸菌调控线粒体生物发生的分子机制，线粒体生物发生与肌纤维类型转化和肉品质之间的关系，并对乳酸菌通过调控线粒体生物发生影响肌纤维类型转化，进而改善肉品质的研究方向进行展望。

1 线粒体与线粒体生物发生概述

关于线粒体的研究至今已有100多年的历史。线粒体是细胞生物氧化磷酸化的重要场所，在线粒体三羧酸循环中，由乙酰辅酶A氧化生成的还原等价物（还原型辅酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体（flavine adenine dinucleotide,reduced，FADH2）通过电子传递系统被氧化为水，在具有线粒体的细胞中产生大量ATP，这些ATP是骨骼肌收缩的能量来源[3]。除了为机体提供大部分能量外，线粒体氧化磷酸化系统还会对细胞糖酵解过程产生影响，从而决定宰后肉品质的形成[4]。线粒体与肉中肌红蛋白的氧化还原状态密切相关，它主要通过影响氧气消耗和高铁肌红蛋白还原来改变肉色及其稳定性，因此影响线粒体结构和功能的因素也会影响肉色[5]。此外，线粒体会释放激活细胞凋亡酶的因子，使其参与细胞凋亡，加速肌原纤维蛋白的降解，从而提高肌肉嫩度[6]。当机体的线粒体受损后会严重影响线粒体功能，降低肌肉蛋白质的合成代谢速率和ATP的合成，导致肌纤维的死亡和肌肉质量的损失，并最终影响肉品质[7-8]。可见，线粒体网络稳态对畜禽宰后肉品质的形成有重要作用，因此，在长期进化过程中，机体形成了一套完善的机制，即线粒体质量控制来保证线粒体数量及质量的相对稳定，包括线粒体生物发生、动态变化（融合分裂）及自噬3 个阶段，其中线粒体生物发生起着至关重要的作用。

尽管文献中广泛使用“线粒体生物发生”（mitochondrial biogenesis）或“线粒体生物合成”这一名词，但目前人们并没有对此给出明确的定义，可见对于线粒体生物发生，人们还缺乏一个清晰的认识。简言之，线粒体生物发生是指骨骼肌在生理和病理条件下表现出的一种适应能力，其结果导致骨骼肌线粒体质量或数量的增加[9]。然而，线粒体生物发生过程相对复杂，主要是因为线粒体是具有自身基因组的半自主遗传细胞器，线粒体生物发生依赖于线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和核DNA（nuclear DNA，nDNA）的共同调控。mtDNA呈双链环状，一个线粒体中可有1 个或多个DNA分子，mtDNA编码了线粒体电子传递链复合物I、III和IV的13 个亚基，虽然比nDNA小得多，但其编码的13 种多肽在线粒体功能中具有重要作用。线粒体生物发生和功能完成大约需要1 500多种多肽，除了mtDNA外，其他的均由nDNA转录、翻译，并通过蛋白输入机制转运到线粒体内。nDNA不仅编码线粒体蛋白的表达，还编码了参与线粒体生物发生的转录因子。

2 调控线粒体生物发生的关键基因

当机体受到运动、营养或骨骼肌收缩等刺激时，细胞内Ca2+浓度和AMP水平增加，导致信号分子活化，这些活化的信号传导途径聚集在过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator-1α，PGC-1α）上，以促进线粒体生物发生（图1）。

图1 线粒体生物发生模型[9]Fig. 1 A proposed model of mitochondrial biogenesis[9]

2.1 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α

PGC-1α是一种重要的核受体辅助激活因子，它能够促进线粒体基因的表达，因此也被认为是线粒体生物发生的主要调节因子。作为线粒体代谢基因的上游诱导剂，PGC-1α与转录因子相互作用，上调NFR-1和NFR-2的转录水平，其中NFR-1能诱导线粒体基因组区段的表达，特别是编码氧化磷酸化组分和线粒体核糖体蛋白的基因[10]。同时PGC-1α对NRF-1和NRF-2的共激活刺激TFAM的表达，从而参与线粒体生物发生过程中mtDNA的转录、复制及拟核的形成[11]。此外，PGC-1α诱导参与氧化磷酸化基因的表达，使其参与电子传递链和ATP合成的最后步骤，从而使脂肪酸完全氧化成线粒体中的水和二氧化碳[12]。可见，PGC-1α协调线粒体生物发生中核和线粒体编码基因的表达，在线粒体生物发生中至关重要。

2.2 沉默信息调节因子

SIRTs是一系列NAD+依赖性组蛋白去乙酰酶，其活性受细胞内NAD+/NADH比值的控制，当NAD+水平升高时SIRTs被激活[13]。研究发现，在人和小鼠中存在7 种SIRTs，其中SIRT1、SIRT3和SIRT5在线粒体生物发生中发挥作用，可动态调节线粒体功能[14]。SIRT1是刺激骨骼肌线粒体生物发生所必需的。Price等利用小鼠实验研究发现，白藜芦醇可以显著增加线粒体生物发生和线粒体功能，但特异性敲除SIRT1基因后再用白藜芦醇处理，并没有观察到线粒体功能改善和线粒体生物发生增加[15]。该结果说明，SIRT1在线粒体生物发生中起着至关重要的作用，可以通过某些手段刺激SIRT1的高表达，从而改善线粒体功能。此外，Gerhart-Hines等的研究也表明，SIRT1可通过去乙酰化和激活PGC-1α来促进线粒体生物发生[16]。在线粒体生物发生过程中，SIRT1诱导PGC-1α的激活，这对于协调核转录因子和核激素受体的激活至关重要，如PPARα、ERRα[17-18]，从而导致核编码的线粒体基因的表达增强。据报道PGC-1α以PPARα和ERRα依赖性方式增加SIRT3和SIRT5的表达[19-20]。SIRT3可以调控线粒体的呼吸作用，增加细胞ATP水平，防止线粒体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基的过度产生，维持线粒体形态和结构稳定，并诱导线粒体生物发生[21]，而SIRT5可能对氧化磷酸化具有积极作用，影响线粒体功能。

2.3 腺苷酸活化蛋白激酶

AMPK是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是机体重要的能量感受器，也是介导线粒体生物发生的另一个关键因素。诸多表明，AMPK可以促进线粒体生物发生和氧化能力，并防止骨骼肌中的线粒体功能障碍[22]。一些研究者认为，由ATP水平变化引起的线粒体生物发生和AMPK的激活有关。2007年，Jager等提出运动、能量限制、骨骼肌收缩活动等外界刺激下，细胞内AMP/ATP比值增加可激活AMPK，活化的AMPK可直接磷酸化PGC-1α的Thr177和Ser538位点，进而促进线粒体生物发生[23]。此外，AMPK亦受细胞内Ca2+水平升高激活的CaMKKβ的影响而被磷酸化和激活。Chen Xiaoling等研究发现，EX527（SIRT1抑制剂）显著降低了AMPK磷酸化水平，该结果表明，AMPK可能作为SIRT1的下游靶点[24]。SIRT1与AMPK进行正反馈循环，因为AMPK提高了细胞中的NAD+水平，从而增强SIRT1活性，进而促进其下游靶基因PGC-1α的表达，反过来激活的SIRT1可对LKB1去乙酰化使其活化，LKB1直接磷酸化AMPK的Thr172并最终导致AMPK激活[22,25]。

总地来说，活化的AMPK和SIRT1通过磷酸化和去乙酰化机制激活PGC-1α，促进线粒体生物发生和提高氧化能力，并防止骨骼肌中的线粒体功能障碍。

3 乳酸菌调控骨骼肌线粒体生物发生

以往人们对线粒体生物发生的研究主要集中在运动方面，关于乳酸菌调控线粒体生物发生的报道还较少。随着研究的不断深入，越来越多的证据表明，乳酸菌可以在骨骼肌细胞内产生多种信号转导事件，这些信号通过改变关键分子的转录活性、mRNA的稳定性、蛋白质表达等，最终引起骨骼肌的线粒体生物发生。在乳酸菌引起的上述改变中，可能的作用途径主要包括：骨骼肌细胞内激酶活化、ROS的信号诱导作用以及PGC-1α信号转录3 个方面（图2）。

图2 乳酸菌影响骨骼肌线粒体生物发生的信号通路Fig. 2 Signaling pathways by which lactic acid bacteria affect mitochondrial biogenesis in skeletal muscle

3.1 骨骼肌细胞内激酶活化

乳酸菌可以激活骨骼肌细胞内各种激酶活性，使激酶参与磷酸化。这些蛋白激酶包括CaMK、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等，它们激活各种转录因子及其辅助蛋白，启动PGC-1α基因的表达，调控线粒体基因的转录。

2016年，Harada等研究表明，短乳杆菌T2102可以增强SIRT1表达[2]。作为AMPK和PGC-1α的上游诱导剂，SIRT1的高表达能激活AMPK和PGC-1α，促进线粒体生物发生。还有研究者提出，可将乳酸菌作为新型AMPK活化剂。Kim等的研究表明，植物乳杆菌发酵豆乳对大鼠肝脏AMPK磷酸化有促进作用，但其作用机制尚不清楚[26]。2018年，Lew等对此进行深入研究，通过体外细胞培养实验证实了乳酸菌可提高AMPK磷酸化水平至与AMPK激活剂相似水平[27]。2019年，Hor等通过给老年大鼠饲喂乳酸杆菌后发现，乳酸杆菌可以降低葡萄糖和胰岛素水平，从而激活AMPK，降低骨骼和肌肉中衰老基因标志物的表达，并增强大鼠的运动能力[28]。可见，乳酸菌可以不同程度地激活AMPK，提高其下游靶基因的表达，从而诱导线粒体生物发生。据Kobilo等报道，AMPK激活剂（AICAR）上调肌肉中的线粒体相关基因，与老年小鼠运动功能的改善相关[29]。以上研究结果说明乳酸菌菌株以AMPK依赖性方式参与骨骼肌线粒体生物发生。

除了激活AMPK表达外，乳酸菌代谢产生的大量乳酸还可以通过增加细胞内Ca2+浓度，提高钙依赖蛋白激酶活性，参与线粒体生物发生。Hashimoto等的研究结果显示，在骨骼肌L6细胞内加入20 mmol/L的乳酸增加了CaMKI和PKC的表达，潜在地增强了细胞对钙的反应能力[30]。这可能是因为乳酸的大量积累使肌肉和血液p H 值下降，糖代谢受到抑制，AT P 生成减少，A D P 增多，AT P/A D P 比值下降，AMPK被激活。同时pH值的下降还影响了肌细胞膜对Na+、K+的通透性，导致肌细胞膜的超极化，肌质网内Ca2+水平升高。Ojuka等通过细胞培养的方法研究发现，咖啡因能刺激L6细胞胞浆内Ca2+水平升高，同时PGC-1α和TFAM蛋白表达增加，NRF-1和NRF-2与核DNA结合增强，诱导线粒体生物发生；当用阻断剂阻断Ca2+从肌质网中释放时该过程被抑制，可见，Ca2+作为第二信使可调节线粒体生物发生[31]。Ca2+介导线粒体生物发生可能是通过钙依赖蛋白激酶和磷酸化酶的活性。Ojuka等研究发现，低浓度的CaMK抑制剂就能完全抑制咖啡因引起的线粒体生物发生，这说明CaMK活性与线粒体生物发生密切相关[32]。在CaMKIV转基因小鼠中，线粒体含量的增加与PGC-1α的表达增加有关[33]。因此，CaMKIV似乎通过PGC-1α发出信号，以促进骨骼肌中的线粒体生物发生。

3.2 活性氧的信号诱导作用

研究显示，乳酸菌可引起线粒体ROS水平升高。2010年，Kim等研究发现，用不同浓度乳酸菌处理MCF-7乳腺癌细胞后，随着乳酸菌浓度增加，ROS的产生量增多，且ROS的产生激活AMPK活性，促使癌细胞的COXII和mTOR的表达降低，从而诱导癌细胞凋亡[34]。因此得出结论，ROS是AMPK的上游信号，乳酸菌会显著增加ROS的产生，激活AMPK，从而参与线粒体生物发生。2007年，Hashimoto等为探究运动训练上调单羧酸转运蛋白-1（monocarboxylate transporter-1，MCT1）表达的内在机制，将细胞在外源性乳酸存在下孵育，结果显示，乳酸浓度的瞬时升高会使线粒体O2消耗加剧，刺激ROS的产生，从而激活NF-κB和NF-E2通路，导致MCT1表达增加[35]。NF-κB是一个普遍表达的转录因子，Bakkar研究发现，IκB激酶/NF-κB通过信号转导抑制骨骼肌细胞分化，促进线粒体生物发生[36]。NF-E2通路与线粒体生物发生关系密切，其中NF-E2相关因子1-2对线粒体生物发生的促进作用已经得到大量研究证实。

ROS主要产生于线粒体，在细胞信号转导中发挥着重要的作用，是机体应对氧化应激时的重要调控因子，这可能是因为ROS可以改变细胞氧化还原平衡状态，从而缓解细胞氧化应激反应。据报道，ROS，特别是H2O2参与了包括PGC-1α在内的骨骼肌细胞基因表达的调控[37]。H2O2处理可通过增加小鼠成纤维细胞CREB的转录活性而增加PGC-1α的表达[38]。CREB是MAPK的组分因子，参与MAPK信号传导途径。有关心肌缺氧的研究显示，心肌细胞缺氧增加了线粒体ROS的产生，ROS参与了适应性反应的信号转导途径，从而诱导p38 MAPK磷酸化[39]。该结果表明，作为线粒体生物发生中重要的信号通路，p38 MAPK的磷酸化是由于H2O2或超氧化物参与了该过程激活的，进而促进了骨骼肌线粒体生物发生。一些实验证实，ROS可能作为一种第二信使在线粒体生物发生的信号传导通路中起某种作用。2000年，Lee等研究发现，人的肺细胞在H2O2的作用下，线粒体的质量和mtDNA数量增加[40]。2002年，Lee等进一步证实，在人细胞复制性衰老过程中，ROS生成量增多，从而导致线粒体数量增加，他们同时还发现，用180 μmol/L H2O2处理复制性衰老细胞后，NRF-1和PGC-1α mRNA水平显著升高[41]。可见线粒体产生的H2O2可能通过尚不完全清楚的通路到达细胞核，激活与线粒体生物发生有关的核基因，增加线粒体生物发生。除此之外，Pasquale等研究发现，乳酸诱导产生的H2O2还有可能增加细胞内钙浓度，通过激活骨骼肌细胞内CaMK活性参与线粒体生物发生[42]。

但与此同时，还有一些研究结果表明，乳酸菌具有抗氧化作用，因此对ROS的产生有明显抑制作用。2007年，Kumar等的研究表明，鼠李糖乳杆菌和拟杆菌属细菌可控制肠道上皮细胞中ROS的生成并最终降低NF-κB的转录活性[43]。2017年，Chattopadhyay等也发现，乳酸菌能减少砷中毒引起的ROS的产生，并抑制NF-κB的活性[44]。可见，对于乳酸菌能否通过促进ROS的生成调控线粒体生物发生目前尚未有定论，仍需进一步深入研究。

3.3 PGC-1α信号转录

PGC-1α处于线粒体生物发生网络系统的上游，是衔接外界刺激信号与线粒体内部功能调节的枢纽。PGC-1α由细胞信号级联系统控制其激活、表达及信号传递，其上游的主要调控因子包括AMPK、p38 MAPK和CaMK。2019年，Jang给雄性小鼠饲喂清酒乳杆菌后发现，清酒乳杆菌可以诱导AMPK活化，提高SIRT1、PGC-1α的表达[1]。可见，乳酸菌可通过AMPK诱导PGC-1α激活、转录并促进其表达进而干预能量代谢。乳酸菌还可使参与p38 MAPK信号传导的基因表达量增加，导致肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，Mef2）和转录激活因子2激活并促进PGC-1α表达[45-46]。而CaMK通过其对应的磷酸化转录因子活化PGC-1α并促进其表达[47]。作为线粒体生物发生的主要调节因子，PGC-1α主要通过激活其下游NRF-1和NRF-2，进而促进TFAM的转录与表达。此外，PGC-1α还可以通过上调ERRα、PPARs等因子的表达进而提高SIRT3和SIRT5的转录水平，这对于调控线粒体生物发生十分重要。

众所周知，乳酸菌在机体内代谢产生大量乳酸，目前学者们认为，代谢物乳酸可能直接作为信号分子物质调控PGC-1α的表达，进而影响骨骼肌线粒体生物发生。乳酸菌代谢产生的大量乳酸用于NAD+的产生，促进糖酵解过程，产生大量能量；同时NAD+的大量产生促进了SIRT1的表达，进而刺激PGC-1α的表达。作为穿梭机制的一部分，乳酸可以在形成的细胞内发挥作用，也可以输出到邻近的细胞、组织或器官中以供利用。2017年，孙景权等采用C2C12肌管细胞模拟研究乳酸对骨骼肌细胞线粒体功能的影响，结果表明，乳酸能诱导线粒体功能蛋白MCAT蛋白表达，增强MCAT活性，参与线粒体功能的维持[48]。其实早在此之前，Hashimoto等就针对乳酸对线粒体生物发生的影响进行深入研究，结果发现，高浓度乳酸可以增加PGC-1α mRNA表达，提高其下游NRF-2的DNA结合活性，从而导致COX的蛋白表达升高[49]。Arnold等研究发现，COXII表达减少还伴随着mtDNA调控因子TFAM大量减少，以及与能量代谢和线粒体合成相关的转录调节因子PGC-1α的下调[50]。目前研究认为COXIV是线粒体生物发生的标志，其活性高低决定了线粒体生物发生水平[51]。2017年，Jeung等为研究乳酸菌对线粒体生物发生的影响，在分化过程中用曲线乳杆菌和植物乳杆菌共同处理前脂肪细胞，结果显示，乳酸菌抑制了线粒体生物发生，线粒体质量下降，NRF-1虽未见明显变化，但其他线粒体生物发生的主要调节因子，如PGC-1α和TFAM表达水平降低[52]。这可能是因为前脂肪细胞的诸多生理特性与骨骼肌细胞不同，从而导致乳酸菌对线粒体生物发生的影响不同。

4 线粒体生物发生影响肌纤维类型转化

肌纤维是组成肌肉组织的基本单位，肌纤维的数目虽在出生时就已基本确定，但肌纤维是动态结构，易受到遗传、营养和生理等诸多因素的影响，可以根据以下途径从一种类型转换为另一种类型：I↔IIa↔IIx↔IIb[53]。肌纤维特性是影响肌肉质量和肉品质的重要因素。大量的研究已经表明，由于氧化型肌纤维主要进行氧化代谢，且肌红蛋白含量和磷脂含量较高，糖原含量较低，肌纤维直径较短，所以当肌肉中氧化型肌纤维比例高时，肉品的肌内脂肪含量、肉色、pH值较高，肌肉的保水性较好，肉质细嫩多汁，肉品风味更好[54]。因此通过各种途径影响肌纤维转化是当前改善肉品质的重要途径。

研究表明，线粒体生物发生与肌纤维的氧化能力和肌纤维类型转化密切相关。Chalkiadaki等研究发现，在骨骼肌中高水平表达SIRT1使线粒体生物发生增加，肌肉中快速收缩纤维向慢速收缩纤维转变，且与肌肉萎缩相关的基因表达量降低[55]。邹彬研究发现，电刺激干预能使线粒体生物发生降低，I型肌纤维数量减少，IIa、IIb和IIx型肌纤维数量增多[51]。此外，Zhang Yong等的研究表明，膳食补充丁酸盐可以显著增加mtDNA的数量，提高NRF-1、TFAM和细胞色素c的mRNA水平，提高线粒体生物发生，同时使I型肌纤维比例升高，IIb型肌纤维的比例降低；此外，随着氧化型肌纤维比例的升高，肌肉的脂肪含量、嫩度和pH值等肉品质指标得到显著改善[56]。可见，线粒体生物发生与肌纤维类型转化和肉品质间必然存在某种联系，而PGC-1α可能是连接两者关系的枢纽。

首先，PGC-1α优先在富含I型肌纤维的骨骼肌中表达，且会使骨骼肌纤维向富含线粒体和高度氧化的I型肌纤维转变[33]，其次，PGC-1α不仅是肌纤维类型转化的关键调节剂，而且也是线粒体生物发生的主要调节因子。Zhang Lin等的一项体外研究证实，当骨骼肌中特异性过度表达PGC-1α后，小鼠和猪的线粒体功能增加，促进了慢速收缩纤维的形成[57]。Handschin等特异性敲除小鼠肌肉中PGC-1α后发现，小鼠的线粒体数量减少，且骨骼肌纤维从氧化型I型和IIa型转向IIx型和IIb型，肌肉损伤程度增加[58]。以上研究结果说明，线粒体生物发生可以通过PGC-1α促进慢速收缩纤维的生成，其作用机制如下：CaN被认为是驱动快速收缩纤维转变为慢速收缩纤维过程中重要的调节因子，而PGC-1α是Ca/CaN/CaMK信号传导的下游靶点，CaMK在转录水平上诱导PGC-1α的表达，提高线粒体生物发生水平[33]。活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，Nfat）和Mef2是钙调磷酸酶信号传导在骨骼肌中表达的两种已知效应物。此外，慢肌钙蛋白I基因中的一个慢速收缩纤维特异性元件含有经典的Nfat位点，这对于慢速收缩纤维的表达是必需的[59]。PGC-1α直接与Mef2相互作用，Mef2在慢肌钙蛋白I基因的慢速收缩纤维特异性元件中物理结合Nfat位点，增加I型肌纤维蛋白的表达[60]。

5 结 语

综上所述，骨骼肌和线粒体生物发生关系密切，进一步明确线粒体生物发生与骨骼肌纤维的关系可为调控肌纤维进而改善肉品质提供新的思路。乳酸菌可以诱导线粒体生物发生增加，在这一过程中，骨骼肌细胞内激酶活化、活性氧的信号诱导作用以及PGC-1α信号转录可能是乳酸菌诱导线粒体生物发生的启动因素。线粒体是细胞有氧代谢中心和能量合成的主要场所，其能量合成的调控因子较多，同时也是各种中间代谢产物的主要来源，这些都使得研究线粒体生物发生变得更加复杂。虽然目前关于乳酸菌与骨骼肌线粒体生物发生的研究仍存在较多空白，但不可否认的是，此研究将有助于人们更加充分地认识乳酸菌调控线粒体生物发生的分子机制，并为今后通过调控肌纤维类型转化改善肉品质提供新途径。