骆冬兰

【摘要】 目的：探究梅毒血清固定患者外周血趋化因子受体、IL-12、IL-10水平变化及意义。方法：选取2016年8月-2019年9月本院收治的梅毒血清固定患者38例为固定组，梅毒治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验转阴患者27例为转阴组，以及进行体检健康者33例为健康对照组。采用流式细胞仪双标法检测三组外周趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3水平，采用双抗体及夹心ELISA法检测三组IL-12、IL-10水平，觀察分析三组外周血趋化因子受体、IL-12、IL-10水平的变化及意义。结果：固定组外周血CCR3表达明显高于转阴组与健康对照组（F=255.441，P<0.05），而CCR5、CXCR3表达均低于转阴组与健康对照组（F=70.674、218.128，P<0.05）;转阴组与健康对照组外周血细胞CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;固定组IL-10水平明显高于转阴组与健康对照组（F=48.205，P<0.05），IL-12比转阴组与健康对照组低，但差异无统计学意义（F=1.173，P>0.05）;ROC曲线显示，外周血趋化因子受体、IL-12、IL-10水平对梅毒血清固定的AUC依次为0.838、0.797、0.592、0.908、0.503、0.660。结论：外周血趋化因子受体、IL-12、IL-10水平对梅毒血清固定有着一定的诊断价值，对梅毒血清固定患者的病情发展起着很重要的作用。

【关键词】 梅毒 血清固定 外周血 趋化因子受体 细胞免疫 细胞因子

[Abstract] Objective： To investigate the changes and significance of chemokine receptor and IL-12， IL-10 in peripheral blood of patients with syphilis serum fixation. Method： From August 2016 to September 2019， 38 patients with syphilis serum fixation treated in our hospital were selected as the fixed group， after syphilis treatment 27 patients with negative serum test of non-Treponema pallidum antigen were selected as the negative group， and 33 healthy people who underwent physical examination were taken as the healthy control group. The levels of CCR3， CCR5， CXCR4 and CXCR3 of three groups were measured by flow cytometry， and the levels of IL-12， IL-10 of three groups were detected by double antibody and sandwich ELISA. The changes and significance of chemokine receptor and IL-12， IL-10 levels in peripheral blood of three groups were observed and analyzed. Result： The expression of CCR3 in peripheral blood of the fixed group was significantly higher than those of the negative group and the healthy control group （F=255.441， P<0.05）， while the expression of CCR5， CXCR3 were lower than those of the negative group and the healthy control group （F=70.674， 218.128， P<0.05）. The difference of CCR3， CCR5， CXCR4 and CXCR3 in peripheral blood cells between the negative group and the healthy control group were not statistically significant （P>0.05）. The level of serum IL-10 in the fixed group was significantly higher than those in the negative group and the healthy control group （F=48.205， P<0.05）， but the serum IL-12 in the fixed group was lower than those in the negative group and the healthy control group （F=1.173， P>0.05）. The ROC curve showed that the level of the peripheral blood chemokine receptor， IL-12 and IL-10 in the serum of syphilis were 0.838， 0.797， 0.592， 0.908， 0.503， 0.660. Conclusion： The level of chemokine receptor， IL-12 and IL-10 in peripheral blood has a certain diagnostic value for syphilis serum fixation， and plays an important role in the development of syphilis serum fixation patients.

[Key words] Syphilis Serum fixation Peripheral blood Chemokine receptor Cellular immunity Cytokine

First-authors address： Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital Affiliated to Southern Medical University， Shenzhen 518028， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.24.009

梅毒是由梅毒螺旋体所引起的一种慢性传播疾病，其主要传播方式是通过性接触及血液传播[1-2]。而梅毒血清固定还可称为血清抵抗，指的是梅毒患者进行规则治疗6～9个月后滴度无明显下降或2年后血清反应仍然没有转阴，目前没有有效的治疗方法，这给患者造成巨大的心理压力。近年来研究发现，梅毒血清固定与机体的免疫系统有着较大的关系[3-4]。本研究通过检测健康者、血清试验转阴以及血清固定患者的外周血趋化因子受体和IL-12、IL-10水平，观察梅毒血清固定患者相对于健康者与转阴患者各指标的变化，分析其对梅毒血清固定患者的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月-2019年9月本院收治的38例梅毒血清固定患者为固定组，27例梅毒治疗后非梅毒螺旋体抗原血清试验转阴患者为转阴组，以及33例进行体检健康者为健康对照组，本次研究患者均确诊梅毒。梅毒血清固定纳入标准：血清固定前已经经过驱梅治疗未出现症状;快速血浆反应素环状卡片实验（RPR）持续阳性，早期持续时间≥1年，晚期持续时间≥2年。排除标准：神经梅毒;男性患者（因本院男性患者少，不便收集标本）;伴有其他免疫系统疾病、严重系统性疾病;感染其他性病等。本研究征得院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血趋化因子受体检测 FITC标记的CD4单抗以及相应同型对照抗体、PE标记的CCR3单抗、CCR5单抗及相应的同型对照PE-IgG、PE-IgG2A购于美国eBioscience公司;APC标记的CXCR4、CXCR3单抗以及其同型对照APC-IgG2A购于美国Abcam公司;流式细胞仪为美国BD公司产品。流式细胞仪双标法检测外周血CD4+ T细胞表面CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3水平的表达。采集三组研究对象空腹外周血5 mL，并即刻送检。步骤如下：（1）分别取用5个离心管标记为A、B、C、D、E，其中A管作为阴性对照;（2）B管加入FITC-CD4单抗（0.5 μg）+PE-CCR3单抗（0.5 μg）;（3）C管加入FITC-CD4单抗（0.5 μg）+PE-CCR5单抗（0.5 μg）;（4）D管加入FITC-CD4单抗（0.5 μg）+APC-CXCR4单抗（0.5 μg）;（5）E管加入FITC-CD4单抗（0.5 μg）+APC-CXCR3单抗（0.5 μg）;（6）各管分别加入100 μL的新鲜抗凝全血，混匀，经过避光孵育、裂解、离心、弃上清液后，各管加入1%多聚甲醛溶液150 μL固定后，上机检测。统计三组外周血CD4+T细胞CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3的表达率。

1.2.2 血清IL-12、IL-10水平检测 使用双抗体夹心ELISA法检测三组血清IL-12、IL-10水平。步骤如下：（1）将标准品IL-12稀释成800、400、200、100、50、25、0 pg/mL（标本用标本稀释液1︰1稀释）;（2）将不同浓度标准品及标本（50 μL/孔）分别加入抗人IL-12单抗包被的相应孔中，封板胶纸封住反应孔，放置在微量震荡器上震荡、37 ℃ 孵育60 min（洗涤液洗板3次并用吸水纸拍干）;（3）每孔加入80 μL的链霉亲和素-HRP，胶纸封住反应孔，室温震荡、37 ℃孵育30 min（洗板3次）;（4）每孔同时加入底物A、B各50 μL，小心轻振荡使其混匀，37 ℃温育10 min（避免光照）;（5）当取出酶标板后，立即快速加入50 μL的终止液，之后应该马上对其测定结果。在450 nm波长处测定各孔的OD值。以標准品的OD值，对其绘制标准曲线，依据标本的OD值在曲线上找出其浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，三组比较采用单因素方差分析，多重对比采用LSD-t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较 固定组38例，均为女性;年龄20～52岁，平均（31.89±7.12）岁;梅毒程度：Ⅰ期8例，Ⅱ期30例;梅毒血清反应素试验滴度1︰1患者8例，1︰2患者13例，1︰4患者16例，1︰8患者1例。转阴组27例，均为女性;年龄21～50岁，平均（32.36±6.47）岁。健康对照组33例，均为女性;年龄22～55岁，平均（33.12±6.23）岁。三组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 三组外周血趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3表达率比较 固定组外周血CCR3表达比转阴组与健康对照组高，而CCR5、CXCR3表达均低于转阴组与健康对照组（P<0.05）;三组外周血CXCR4表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;转阴组与对照组外周血细胞CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 三组IL-12、IL-10水平比较 固定组IL-10水平比转阴组与健康对照组高（P<0.05），IL-12比转阴组与健康对照组低，但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.4 外周血趋化因子受体、IL-12、IL-10水平对梅毒血清固定的诊断价值 ROC曲线分析显示，外周血趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3以及IL-12、IL-10水平对梅毒血清固定的AUC依次为0.838、0.797、0.592、0.908、0.503、0.660，部分诊断准确性一定，见图1、2和表3。

3 讨论

梅毒是临床中常见的一种性传播疾病，近年来在我国的发病率大幅度升高。临床中，一些梅毒患者在接受规范的驱梅治疗后，检验外周血快速血浆反应素环状卡片实验（RPR），发现还是一直呈现出阳性，导致出现血清固定的病症[5-6]。而今梅毒血清固定的现象已经非常普遍，占梅毒患者的较大一部分比例[7-8]。梅毒血清固定对患者来说危害是非常大的，相关研究指出，血清固定会造成患者的内脏器官、神经系统等受到不同程度的损伤，还会传播给下一代，甚至会导致胎儿在围生期死亡等危险情况出现[9-10]。许多研究已指出，梅毒血清固定与机体的细胞免疫功能有着密切的关系[11-13]。

趋化因子是一类在淋巴细胞募集中具有非常重要作用的蛋白质超家族，趋化因子受体则是一类介导趋化因子与G蛋白相偶联的受体[14]，其表达是趋化因子发挥作用的一个比较关键的决定因素。趋化因子及其受体能够精确的调节免疫系统的各种反应，在机体的生理病理过程中起着很重要的作用[15-16]。此次研究结果发现，固定组与转阴组及健康对照组比较，外周血趋化因子受体CCR3水平显著增高（P<0.05），而CCR5、CXCR3水平均显著降低（P<0.05）;转阴组外周血趋化因子受体与健康对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。表明机体的正常免疫功能对于梅毒血清反应素试验转阴来说，是一个比较重要的条件。机体免疫功能低下，会造成对梅毒螺旋体免疫应答异常，导致部分梅毒螺旋体避过机体的细胞免疫，不能及时清除所有的梅毒螺旋体，从而感染出现血清固定[17-18]。

正常情况下健康者身体中，血清细胞因子IL-12、IL-10是处于一个相对比较动态平衡的状态，它们能对人体细胞免疫系统的稳定进行调节与维持。但当患者出现梅毒血清固定后，使得IL-12、IL-10水平发生变化，造成免疫系统的稳定性发生改变[19]。此次研究中，三组IL-10水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），且梅毒血清固定组IL-10水平显著高于转阴组与健康对照组。此研究结果与关杨等[20]研究一致。而三组IL-12水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。由此可见，梅毒血清固定使机体IL-10水平上升，进而抑制T细胞功能并阻碍Th1介导的细胞免疫应答，从而使得机体中的保护性清除TP的细胞免疫功能降低，从而导致免疫失去平衡。同时当梅毒患者接受正规驱梅治疗后，机体内梅毒螺旋体得到清除，细胞免疫功能就能慢慢地恢复到正常水平。

本研究通过外周血趋化因子受体、IL-12、IL-10水平的ROC曲线，了解各指标对梅毒血清固定的诊断价值，结果显示趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR3以及IL-10水平在梅毒患者机体中起着重要的作用。在临床中对梅毒患者的治疗，在原有的常规抗生素驱梅治疗，还需要配合一些免疫调节剂来增强机体的免疫功能，降低梅毒血清固定的发生率。由于此次研究对象数量不多，研究结果可能会有一定的不足，故今后还有待进一步增加研究对象深入研究分析。

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（收稿日期：2020-01-08） （本文编辑：程旭然）