胡冬冬 刘韬 石少波 黄燕 梁飒 胡丹

[摘要] 目的 探討丹曲林（DTL）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心室细胞钙运转及心功能的影响。 方法 将57只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、CHF组和干预组（n = 19），分别给予生理盐水、异丙肾上腺素（ISO）及ISO+DTL连续注射2周。干预2周后，行血流动力学和血清脑钠肽（BNP）水平检测。分离心室细胞，采用动缘探测系统记录心肌细胞收缩;心肌细胞钙荧光染料Fura-2 AM孵育后记录心室细胞钙瞬变（CaT），测量内质网钙容量（[Ca2+]SR）。Western blot检测心室Ryanodine 2型受体（RyR2）、内质网钙泵（SERC2a）及受磷蛋白（PLB）表达量。结果 与对照组比较，CHF组左室舒张末期压力（LVEDP）、血清BNP水平、心室细胞舒张期Ca2+水平（[Ca2+]i）均显著升高（P < 0.01），CaT衰减时间、心室细胞收缩达峰时间（TP）及细胞舒张50%时间（TR50）均显著延长（P < 0.01），而左室收缩末期压力（LVESP）、心室收缩期压力上升及舒张期下降最大速度（±dP/dtmax）、心室细胞收缩百分比、CaT幅度、[Ca2+]SR、心室RyR2及SERCA2a表达量均显著降低（P < 0.01）。与CHF组比较，干预组LVEDP、血清BNP水平、[Ca2+]i均显著降低（P < 0.01），CaT衰减时间、TP及TR50均显著缩短（P < 0.01），而LVESP、±dP/dtmax、心室细胞收缩百分比、CaT幅度、[Ca2+]SR、心室RyR2及SERCA2a表达量均显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 DTL干预可改善CHF大鼠心功能，可能与DTL修复心室细胞钙运转有关。

[关键词] 心力衰竭;丹曲林;钙运转

[中图分类号] R541          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0004-05

Effects of Dantrolene on calcium handling of ventricular myocytes and cardiac function in rats with chronic heart failure

HU Dongdong   LIU Tao   SHI Shaobo   HUANG Yan   LIANG Sa   HU Dan

Department of Cardiology， People′s Hospital of Wuhan University  Cardiovascular Research Institute of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Cardiology， Hubei Province， Wuhan   430060， China

[Abstract] Objective To discuss the effects of Dantrolene （DTL） on calcium handling of ventricular myocytes and cardiac function in rats with chronic heart failure （CHF）. Methods According to the random number table method， 57 adult male SD rats were assigned to control group， CHF group and intervention group （n = 19）， which were given normal saline， Isoproterenol （ISO）， and ISO+DTL， for 2 weeks. Two-week later， the hemodynamic parameters and serum B-type natriuretic peptide （BNP） level were measured. The ventricular myocytes were isolated， then the cell contractility was automatically detected by the video edge-detector system. The calcium transient （CaT） and sarcoplasmic reticulum （SR） calcium content （[Ca2+]SR） were recorded by loading cardiomyocytes with Fura-2 AM. The protein levels of ryanodine receptor 2 （RyR2）， SR Ca2+-ATPase （SERCA2a） and phospholamban （PLB） were detected by Western blot. Results Compared with control group， left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）， serum BNP level， diastolic intracellular Ca2+ level （[Ca2+]i） were significantly increased in CHF group （P < 0.01）， decay time constant （tau） of CaT， time to peak （TP） of cell contraction， time to 50% cell relaxation （TR50） were significantly extended in CHF group （P < 0.01）， while left ventricular end systolic pressure （LVESP）， ±dP/dtmax， cell shortening percentage， CaT amplitude， [Ca2+]SR， the protein levels of RyR2 and SERCA2a were significantly decreased in CHF group （P < 0.01）. Compared with CHF group， LVEDP， serum BNP level， [Ca2+]i， decay time constant of CaT were significantly decreased in intervention group （P < 0.01）， decay time constant of CaT， TP of cell contraction， TR50 were significantly shortened in intervention group （P < 0.01）， whereas， LVESP， ±dP/dtmax， cell shortening percentage， CaT amplitude， [Ca2+]SR， the protein level of RyR2 and SERCA2a were markedly increased in intervention group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion DTL treatment can improve cardiac function in rats with CHF， which may be related to the repair of calcium handling of ventricular myocytes by DTL.

[Key words] Heart failure; Dantrolene; Calcium handling

慢性心力衰竭（CHF）是心血管疾病发展的终末阶段，严重危害人类健康。心肌细胞钙运转异常是CHF发生的重要机制[1-4]。丹曲林（DTL）是一种Ryanodine受体（RyR）稳定剂，临床上常用于恶性高热的治疗。有证据显示，DTL具有修复心肌细胞钙稳态的作用[5-7]。本研究通过DTL持续干预CHF大鼠，探讨DTL对CHF大鼠心室细胞Ca2+运转及心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Ⅱ型胶原酶（美国Worthington公司，222-938-1）;钙荧光指示剂Fura-2 AM（美国Invitrogen公司，E0801A）;戊巴比妥钠（武汉众一生物，774080）;普通台式液配方（mmol/L）：NaCl 130、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl2 1.0、Na2HPO4 0.3、HEPES 10.0和Glucose 10.0，NaOH调节pH至7.4;异丙肾上腺素（ISO）、DTL、ryanodine 2型受体（RyR2）抗体（英国Abcam公司，gr324870-4）、肌浆网钙泵（SERCA2a）抗体（英国Abcam公司，gr318-2545-3）及受磷蛋白（PLB）抗体（英国Abcam公司，gr3207682-3）;血流动力学检测换能导管（美国Millar公司，型号：micro-tip）;血流动力学记录PowerLab采集系统及分析软件Chart 7.0软件（澳大利亚AD公司，型号：4SP）;心肌细胞边缘探测及钙成像系统（美国Ionoptix公司，型号：6.5.1.92）;大鼠脑钠肽（BNP）-32酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉华联科生物，437YNZJ3BT）。

1.2 实验分组

雄性SD大鼠（n = 57），购自武汉大学医学部实验动物中心，体重200～250 g，采用随机数字表法将其分为对照组、CHF组和干预组（n = 19）。参照文献[8-9]，CHF组给予ISO[5 mg/（kg·d）]腹腔注射，干预组腹腔注射ISO[5 mg/（kg·d）]和DTL[2 mg/（kg·d）]，对照组则注射生理盐水[1 mL/（kg·d）]，所有药物连续注射2周。

1.3 血流动力学评价

每组选取8只动物麻醉后，分离右颈总动脉，将一根2F的换能导管插入右颈总动脉直至左心室。稳定10 min后，采用PowerLab/4SP系统和Chart 7.0软件开始记录心内压力信号和心率，测量左室收缩末期压力（LVESP）、左室舒张末期压力（LVEDP）、心室收缩期压力最大上升速度（+dP/dtmax）及舒张期压力最大下降速度（-dP/dtmax），用以评价心功能。

1.4 血清BNP水平检测

動物完成血流动力学实验后，自心脏取血2 mL，血液室温静置1 h后给予5000 r/min（r = 8 cm）离心5 min制备血清。采用BNP-32酶联免疫吸附测定试剂盒检测血清BNP水平。具体检测步骤按照相关说明书进行，每个样本测量2次，以pg/mL表示。

1.5 心肌细胞分离

每组选取6只动物肝素化（400 U，腹腔注射）10 min后麻醉开胸，剪下心脏，行主动脉插管后连接于离体心脏Langendorff系统。参照文献[10]，采用Ⅱ型胶原酶灌注法进行心室肌细胞分离。将收集的心室细胞逐步复钙（终浓度为1 mmol/L Ca2+），用于钙成像实验。

1.6 心肌细胞收缩力及钙成像实验

每组选取15个心肌细胞，应用可视化动缘探测系统及钙荧光显微镜进行心室细胞收缩力及钙成像实验。心肌细胞肌小节收缩幅度由系统自动采集及分析。参照既往研究行钙成像实验[10]，通过一对铂金电极发放场刺激（1 Hz，2倍起搏阈值，脉宽2 ms），记录8个连续的心室细胞钙瞬变（CaT）。选取5个CaT计算平均值，参照既往研究[11]测量心室细胞舒张期Ca2+浓度（[Ca2+]i）、CaT幅度及CaT衰减时间。此外，参照既往文献[12]，采用咖啡因诱导的CaT评价心肌细胞内质网钙容量（[Ca2+]SR），步骤如下：心室细胞完成Fura-2 AM负载后，给予1 Hz场刺激2 min，随后停止刺激，于细胞正上方滴入咖啡因（10 mmol/L），记录咖啡因诱发的CaT，测量CaT幅度用以评价[Ca2+]SR。

1.7 钙运转关键蛋白表达量检测

每组选取5只动物麻醉后开胸，剪下心脏，取左心室组织放置于-80℃冰箱保存。使用RIPA裂解缓冲液提取心肌标本总蛋白，随后进行蛋白浓度的测定。各样品取50 μg蛋白上样电泳，根据蛋白分子量配制相应使用的PAGE胶电泳。对心室RyR2、SERCA2a及PLB表达量进行Western blot检测。

1.8 统计学方法

统计学分析及作图均采用Graphpad prism 5.0软件。本研究中连续变量采用均数±标准差（x±s）表示，采用单向方差分析进行多组间比较，采用Tukey post hoc检验进行组间两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较

与对照组比较，CHF组LVESP及±dP/dtmax显著降低，而LVEDP和血清BNP水平显著升高（P < 0.01）。与CHF组比较，干预组LVESP及±dP/dtmax显著升高，而LVEDP和血清BNP水平则显著降低（P < 0.01）。见图1。

2.2 各组大鼠心室细胞机械功能指标比较

与对照组比较，CHF组心室细胞收缩达峰时间（TP）及心肌细胞舒张50%时间（TR50）均显著延长（P < 0.01），而心室细胞收缩百分比显著降低（P < 0.01）。与CHF组比较，干预组心室细胞TP及TR50均显著缩短（P < 0.01），而心室细胞收缩百分比显著升高（P < 0.01）。见图2。