谭宇彦 王晶敏 王 栋

(1.三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 普外科， 湖北 宜昌 443003； 2. 东南大学附属中大医院 普外科， 江苏 南京 210009)

胆囊胆固醇结石是一种严重危害人类健康的常见病，我国发病率为4.42%～11%[1]。胆固醇结石成因复杂，胆囊收缩功能障碍在胆固醇结石的形成中起关键的作用[2]。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是分布在消化道自主神经末梢和平滑肌细胞之间的一类特殊细胞，特异性表达Ⅲ型酪氨酸激酶生长因子受体c-kit，主要参与消化道基本电节律的产生和调控，对维持消化道正常运动功能起决定性作用[3]。研究表明ICC存在于动物和人类胆囊，其功能异常与胆囊结石发病相关，并已成为研究热点[4]。本实验通过构建兔胆囊胆固醇结石模型，研究胆固醇结石形成过程中胆囊收缩功能与ICC凋亡的关系，并对其机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 兔胆囊结石模型建立

成年新西兰大白兔52只(雌雄不限)，由江苏省农业厅模式动物研究所提供。依次称重编号随机分为实验组(n=32)和对照组(n=20)，分别给予高胆固醇致石饲料和普通饲料喂养6周[5]。6周后禁食24 h、禁饮12 h行B超检查成石情况。

1.2 主要试剂

胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)(美国Sigma公司)；二乙基乙酰苯胺亚氨二醋酸(99mTc-EHID)(南京森科医药技术有限公司)；丙酮(成都科隆化工试剂厂)；25%乌拉坦溶液(东南大学机能实验室)；正常山羊血清(丹麦DAKO 公司)；兔抗人CD117多克隆抗体、Cy3标记山羊抗兔二抗IgG(美国Santa Cruz公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL试剂盒(罗氏公司)，总胆固醇测定试剂盒、总胆汁酸测定试剂盒、磷脂测定试剂盒(北京金豪制药有限公司)。

1.3 主要设备

单光子发射计算机断层扫描仪(SPECT)(德国Siemens公司)，FV1000共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，AU5400全自动生化仪(美国贝克曼公司)。

1.4 胆囊收缩功能核素显像扫描

对照组和实验组各9只，25%乌拉坦溶液经兔耳缘静脉缓慢推注(4 mL/kg)，待兔麻醉后仰卧固定于兔台，探头置于中上腹部，耳缘静脉弹丸注射1 mL99Tcm-EHIDA (3～5 mci/mL)，即刻起开始动态采集数据，采集矩阵为64×64，放大倍数1.5，采集速度1帧/min，待胆囊显像后并达到最浓聚时，耳缘静脉注射CCK(20 μg/kg)，继续动态采集60 min。利用软件工具勾画胆囊感兴趣区(region of interest，ROI)，由计算机程序自动绘制胆囊时间-放射性曲线，记录两组胆囊半排时间和30 min的排胆分数(gallbladder ejection fraction，GEF)。GEF按照以下公式计算：

1.5 胆汁胆固醇饱和指数测定

应用全自动生化分析仪测定胆汁总胆汁酸、胆固醇、磷脂浓度。根据所测结果查Carey表[6]，得出理论胆固醇浓度，再计算胆汁胆固醇饱和指数(cholesterol saturation index，CSI)。CSI=实际胆固醇摩尔百分比浓度/理论胆固醇摩尔百分比浓度。

1.6 胆囊组织氧化应激指标测定

取80～100 mg新鲜胆囊标本4℃生理盐水漂洗后匀浆、离心，取上清液测量MDA、GSH-PX和T-SOD的含量。

1.7 胆囊组织全层铺片CD117/TUNEL双染ICC凋亡荧光检测

新鲜胆囊灌注丙酮固定24 h，沿纵轴剖开胆囊，剥离胆囊黏膜及黏膜下层，保留胆囊肌层，并修剪成2 cm×2 cm大小。再用PBS漂洗3次，山羊封闭血清孵育1 h后，加入CD117一抗(1∶100)，4℃冰箱过夜。PBS漂洗后加入二抗(1∶100)室温下反应45 min。PBS洗脱二抗，每份标本加50 μL TUNEL检测液反应1 h，PBS避光漂洗后捞片、风干，抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜下观察，随机挑选10个200倍随机视野，利用image pro plus 5.0软件计数CD117+/TUNEL+双阳性细胞。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 兔胆囊结石模型评估

B超发现，对照组兔胆囊内未见有结石和其他病变；实验组兔胆囊腔内可见单个或多个强回声光团，部分后方有声影，胆囊透声差，见表1。

表1 两组兔死亡率和成石率[n(%)]

2.2 两组胆囊收缩功能比较

计算机程序根据所选ROI区，自动绘制胆囊时间-放射性曲线(见图1)。结果显示注射CCK后30 min，实验组GEF为86.30%±2.30%，对照组为60.00%±4.80%，两组结果比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A；实验组胆囊半排时间为25.60±2.80 min，较对照组17.30±3.10 min明显延迟，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2B。

2.3 两组胆汁胆固醇饱和指数比较

实验组胆汁胆固醇浓度、胆固醇饱和指数显著升高，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组胆汁CSI比较

注：与对照组相比，aP<0.05

2.4 两组胆囊组织氧化应激情况比较

两组胆囊组织氧化应激指标检测结果见图3。对照组T-SOD为94.81±8.07 U/mgprot，实验组为46.95±5.36 U/mgprot；对照组GSH-PX为34.04±2.3 U/mgprot，实验组为28.48±1.31 U/mgprot。对照组胆囊组织MDA为0.56±0.09 nmol/mgprot，实验组为1.00±0.15 nmol/mgprot。上述指标两组间比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.5 两组胆囊组织ICC凋亡情况

在激光共聚焦显微镜下观察，胆囊全层铺片中CD117+的ICC发红色荧光，呈网络状结构，TUNEL染色标记的凋亡细胞发绿色荧光，CD117+/TUNEL+双标的细胞为凋亡的ICC，发黄色荧光，见图4。正常胆囊组织可见极少的CD117+/TUNEL+双标细胞，而结石胆囊组织CD117+/TUNEL+双标细胞明显增多(6.42±1.28 vs 14.28±3.52 cells/200，P<0.05)。

3 讨论

胆囊收缩功能下降是胆囊结石形成的重要原因，胆囊ICC减少对胆囊收缩功能的影响也起到了至关重要的作用。ICC是西班牙神经解剖学家Ramón Santiago y Cajal通过甲基蓝及嗜银染色法在胃肠道奥尔巴赫神经丛、深肌层、环行肌层内观察到的一类特殊间质细胞[7]。ICC主要的功能是：①慢波(slow wave, SW)电位的起搏细胞：ICC产生的SW电位，是消化道运动的基础，决定着平滑肌收缩节律和传播方向；②SW电位的传导细胞：SW电位通过ICC网络传播给与之相连的平滑肌细胞，刺激并调节平滑肌收缩活动；③介导神经信号传递：消化道神经选择性地支配ICC，控制释放多种神经递质作用于ICC，影响ICC的电生理活动和平滑肌SW频率的产生，调控消化道运动[8]。ICC的减少或缺失与多种消化道动力障碍性疾病，如贲门失弛缓症、糖尿病性胃轻瘫、慢传输型便秘、先天性巨结肠等密切相关[9]。

2007年Lavoie等[10]首次在豚鼠胆囊内发现ICC，从形态学和生理学证明了ICC存在于胆囊中，并发现胆囊ICC有自发的细胞内钙震荡，参与胆囊平滑肌慢波电位的起搏，调控胆囊的收缩运动。Pasternak等[11]在患者切除的无瘤胆囊上确定了人类胆囊存在ICC，并认为胆囊能产生和传播自发性节律与其密不可分。当用亚甲蓝+光照射特异性破坏胆囊ICC后，胆囊肌条收缩能力显著下降，胆囊SW电位明显消失，这进一步证实了ICC对胆囊运动有直接影响[12]。ICC特异性表达III型酪氨酸激酶生长因子受体c-kit[7]。消化道肥大细胞亦表达c-kit，主要位于消化道粘膜层和粘膜下层，而胆囊ICC位于平滑肌层[13]。实验中我们剥离胆囊黏膜及黏膜下层，保留胆囊肌层，尽可能消除肥大细胞的影响。全层铺片是研究消化道肌间神经丛和ICC形态和数量变化常用的一种方法，通过这项技术制备全层铺片后再进行CD117/TUNEL双染，能直观地显示ICC网络结构和凋亡的变化。

在胆囊结石发病过程中，ICC减少的原因和机制仍不清楚。Matyja等[14]推测成石胆汁中高胆固醇含量与胆囊结石患者胆囊ICC减少可能有关。动物实验发现，用高胆固醇饮食喂养豚鼠，胆囊组织c-kit mRNA及蛋白含量明显减少[15]，在胆囊组织中表达c-kit的主要是ICC。在许多与胆固醇代谢紊乱相关的疾病和动物实验研究中均发现，高胆固醇可诱发氧化应激反应导致组织细胞凋亡[16，17]。当组织内胆固醇浓度增高时，氧自由基系统激活，释放大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，使组织处于氧化应激状态。同时，胆固醇浓度增高，可使血管内皮粘附因子的表达增加，导致白细胞粘附和渗透活动增强，发生血小板-内皮细胞聚集，使内皮细胞ROS产生增多[18]。一项临床双盲随机对照试验发现，胆囊结石患者口服熊去氧胆酸调节肝脏胆固醇代谢，可降低胆汁中胆固醇浓度，同时可明显降低胆囊组织中脂质过氧化水平[19]。高胆固醇诱发的氧化应激反应与细胞凋亡有着密切的关系。当胆固醇浓度超过30 μg/mL时，血管组织中ROS水平明显增加，动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞发生凋亡[20]。在体外培养的MIN6细胞株中，逐渐增加培养基中游离胆固醇的含量，以剂量-时间依赖性方式诱导了细胞凋亡，而且细胞内ROS水平增加也暗示了胆固醇负荷后产生持久的高水平ROS，直接诱导了MIN6细胞的凋亡[21]。

综上所述，我们的研究发现：实验组胆汁CSI明显高于对照组，胆囊组织氧化应激指标MDA较对照组明显上升，而抗氧化应激指标T-SOD、GSH-PX显著下降，结石胆囊组织中ICC凋亡显著增多。以上结果显示，胆囊胆固醇结石形成过程中，胆汁中胆固醇过饱和可诱发胆囊组织氧化应激反应，促使ICC凋亡。然而，高胆固醇通过氧化应激诱发ICC凋亡是通过哪一关键凋亡信号通路还有待进一步研究。