郭叶青 王晓艳

(1. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 呼吸与危重症医学科， 湖北 宜昌 443003; 2. 中南大学 湘雅三医院 消化内科， 湖南 长沙 410013)

结肠癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来我国结肠癌的发病率、死亡率有逐步升高趋势，严重危害国民健康[1]。手术、化疗、免疫治疗等是目前主要治疗方案，但结肠癌晚期患者治疗效果欠佳，且预后较差，其主要原因与肿瘤的侵袭转移有关。结肠癌的侵袭转移机制非常复杂，这一过程涉及肿瘤细胞的上皮-间质转换、侵袭黏附、血管生成、胞外基质的降解及微环境趋化作用[2]。因此，深入研究结肠癌发生发展的分子机制，对于早期发现结肠癌的侵袭转移及预测患者预后具有重要意义。

microRNA是一种小分子的非编码RNA，可参与基因转录后水平调控，通过与下游靶基因mRNA的完全或不完全互补结合，诱导靶基因mRNA发生降解或抑制其翻译，发挥负调控靶基因表达的作用[3]。目前已有较多研究证实miR-126与肿瘤的增殖及转移发生相关[4-6]。其下游靶蛋白趋化因子受体4(chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4)是趋化因子配体12 (chemokine C-X-C motif ligand 12， CXCL12)的特异性受体。CXCL12/CXCR4轴参与调控胃癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等多种肿瘤的增殖及侵袭转移[7-10]。然而，CXCR4在结肠癌的发生发展及侵袭转移中的作用尚未阐明。已有研究证实，CXCR4为miR-126的靶基因，miR-126可抑制CXCR4蛋白的表达[11]。本文分别运用原位杂交、免疫组化方法检测结肠癌组织芯片中miR-126、CXCR4蛋白表达，分析二者与结肠癌临床病理特征之间的关系，并进行生存分析，探讨miR-126和CXCR4与结肠癌生物学行为以及患者预后的相关性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织芯片

本研究所用的2张组织芯片购自上海芯超公司，芯片的编号是OD-CT-DgCo105-106，每张组织芯片上含75例结肠癌患者的癌组织及癌旁的正常黏膜各1点，共150点。组织芯片上每块组织直径1.5 mm，厚4 μm，其中男性患者38例，女性患者37例，共75例。所有患者均在2012年1月～2013年1月行手术治疗，均具备完整随访资料。截至2018年10月，以最后一次的随访日期或者患者的死亡日期为随访结束点；以手术日期到随访结束或者死亡的日期为生存期；最短的随访时间为1个月，最长的随访日期为66个月。患者年龄分布范围为30～82岁，年龄≥60岁患者49例，<60岁患者26例。患者手术前均未接受化放疗，其中Dukes A期12例，Dukes B期23例，Dukes C期31例，DukesD期9例。高分化10例，中分化53例，低分化12例。合并淋巴结转移37例，无淋巴结转移38例。标本均通过HE染色验证。

1.1.2 主要试剂

hsa-miR-126原位杂交探针购自Exiqon公司，hsa-miR-126探针序列：/5DigN/GCATTATTACTCACGGTACGA/3Dig_N/。鼠抗人单克隆抗体CXCR4购自美国Santa Cruz公司。DAB显色试剂盒、即用型免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 原位杂交方法

组织芯片常规脱蜡水化，3%过氧化氢灭活，3%胃蛋白酶消化，0.1 mol/L PBS缓冲液固定；滴加预杂交液20 μL，电热恒温箱59℃孵育3 h；滴加20 μL杂交液，电热恒温箱59℃孵育24 h；37℃的SSC缓冲液洗涤切片；滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，在湿盒中避光反应NBT/BCIP 24 h；加200 μL核固红染液1 min，酒精脱水；封片、拍照。采用已知的结肠癌原位杂交阳性切片作阳性对照，以不加探针的预杂交液作为阴性对照。

1.2.2 原位杂交结果评判标准及观察评分

综合miR-126阳性表达细胞数比例及染色强度两个指标评分。阳性表达细胞数比例评分标准：<5%，记0分；5%～25%，记1分；26%～50%，记2分；51%～75%，记3分；>75%，记4分。染色程度强弱评分：淡红色，记0分；浅蓝紫色，记1分；蓝紫色，记2分；深蓝紫色，记3分。两位病理专家根据上述的评分标准进行双盲评分后，取两项相加为最终评分。结果的评判：0分为阴性(-)；1～2分为弱阳性(+)；3～5分为中等阳性(++)；6～7分为强阳性(+++)。

1.2.3 免疫组化

结肠癌组织芯片经烤片、脱蜡、水化、抗原修复，PBS液漂洗之后以3%过氧化氢孵育阻断内源性过氧化物酶，PBS液漂洗后滴加非免疫动物血清封闭。室温孵育，PBS冲洗后滴加CXCR4抗体(1∶2 000)，置于4℃冰箱过夜。PBS液漂洗后滴加二抗，室温30 min，PBS液漂洗，DAB试剂显色，苏木精进行复染，再行脱水、透明、封片。用已知的阳性染色结肠癌组织切片作阳性对照，用PBS液替代一抗为阴性对照，树胶干后显微镜下拍照。

1.2.4 免疫组化评判标准及观察评分

根据目的蛋白表达阳性的细胞数比例及染色强度评分。染色程度的强弱评分：阴性染色为0分；淡黄色染色，为1分；棕黄色，为2分；棕褐色染色，为3分。阳性细胞计数：<5%，记0分；5%～25%，记1分；26%～50%，记2分；51%～75%，记3分；>75%，记4分。两位病理专家根据上述的评分标准进行双盲评分后，取两项相加为最终评分。结果的评判：0分为阴性(-)；1～2分为弱阳性(+)；3～5分为中等阳性(++)；6～7分为强阳性(+++)。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计数资料采用率(%)表示，各组间率的比较采用卡方检验或者Fisher确切概率法。相关性分析采用Spearman相关性分析。生存分析方法采用Kaplan-Meier法、Log-rank检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-126在结肠癌组织及癌旁组织中的表达及与结肠癌临床病理特征的关系

由于脱片原因导致部分标本未能染色成功。因此，本研究共分析了75例患者结肠癌组织及59例癌旁正常粘膜组织中miR-126的表达。结果显示，结肠癌组织及癌旁正常粘膜组织中miR-126阳性表达定位在胞浆，阳性染色呈深蓝紫色(见图1)。统计分析结果显示，结肠癌组织中miR-126的表达显著低于癌旁正常黏膜(64.00% vs. 91.53%)，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。进一步分析结果显示，miR-126的表达与结肠癌有无淋巴结转移、临床分期明显相关，差异具有统计学意义(均P<0.05)，而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等无明显相关性(均P>0.05)，见表2。

表1 miR-126在结肠癌及癌旁正常粘膜组织中的表达[n(%)]

表2 miR-126与结肠癌临床病理特征间的关系[n(%)]

2.2 miR-126的表达对结肠癌患者术后生存时间的影响

Kaplan-Meier生存分析结果示，miR-126阳性表达组的术后生存时间为53.14±2.93月，5年生存率是64.20%；阴性表达组术后生存时间为33.00±2.28月，5年生存率为42.80%。miR-126阴性表达组的生存率明显低于阳性表达组。Log-rank检验结果显示，两组间的生存率差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 CXCR4在结肠癌组织及癌旁组织中的表达及与结肠癌临床病理特征的关系

由于脱片原因导致部分标本未能染色成功。因此，本研究共分析了66例患者结肠癌组织及64例癌旁的正常粘膜组织中CXCR4蛋白的表达。结果显示，结肠癌组织及癌旁正常粘膜组织中，CXCR4蛋白表达阳性定位在胞浆、胞膜，阳性的染色呈棕黄色或者棕褐色(见图3)。统计分析结果显示，结肠癌组织中CXCR4蛋白表达显著高于癌旁正常黏膜(P<0.05)，见表3。进一步分析发现，CXCR4蛋白表达与结肠癌有无淋巴结转移、临床分期明显相关(均P<0.05)，而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度等无关(均P>0.05)，见表4。

2.4 CXCR4的表达对结肠癌患者术后生存时间影响的分析

Kaplan-Meier生存分析结果显示，CXCR4蛋白表达阳性组的术后生存时间为38.79±4.67月，5年生存率为38.10%；而CXCR4蛋白表达阴性组术后生存时间为53.84±3.20月，5年生存率达61.20%。CXCR4蛋白阳性表达组的生存率明显低于阴性表达组。两组间的生存率经Log-rank检验，结果示差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

表3 CXCR4蛋白在结肠癌及癌旁正常粘膜组织中的表达[n(%)]

表4 CXCR4蛋白表达与结肠癌临床病理特征间的关系[n(%)]

2.5 结肠癌组织中miR-126、CXCR4蛋白表达的相关性分析

在48例miR-126表达阳性的结肠癌组织中，CXCR4蛋白阴性表达占14例；在50例CXCR4阳性的结肠癌组织中，miR-126阴性表达的占16例。经Spearman等级相关分析结果发现，结肠癌组织中miR-126与CXCR4蛋白表达负相关(r=-0.43，P<0.05，见表5)。

表5 结肠癌组织中miR-126与CXCR4蛋白表达的关系

3 讨论

miRNA调控人类约三分之一的基因表达，且参与多个肿瘤相关基因的调控。人类的miRNA基因中有一半以上定位于肿瘤相关基因，这个区域易发生染色体的缺失、易位或者异常扩增[12]。大量研究发现，miR-126、miR-34b、miR-143、miR-448、miR-766等多种miRNA的异常表达与结肠癌的发生发展相关[13-16]。Wang等[17]研究发现，miR-126可通过调控胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)，从而抑制胃癌细胞的迁移、侵袭。Alhasan等[18]研究证实，miR-126可通过靶向抑制血管内皮生长因子基因表达，进而抑制乳腺癌的侵袭转移。本研究结果显示，结肠癌组织中miR-126的表达阳性率明显低于癌旁正常黏膜组织，且miR-126的表达与结肠癌患者临床分期、有无淋巴结转移明显相关，而与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤大小等无关。进一步行生存分析显示，miR-126阴性表达组生存率明显低于miR-126表达阳性组。此结果提示，miR-126在结肠癌中发挥抑癌基因的作用，可能与抑制结肠癌的侵袭转移有关。CXCR4在肿瘤的增殖、血管生成及侵袭转移过程中发挥重要作用[19-21]。本研究结果显示，癌组织中CXCR4蛋白的表达阳性率明显高于癌旁正常黏膜组织，且CXCR4蛋白的表达与结肠癌患者临床分期、有无淋巴结转移明显相关。进一步行生存分析显示，CXCR4蛋白阳性表达组生存率明显低于CXCR4蛋白表达阴性组。此结果提示，CXCR4蛋白可能促进结肠癌侵袭转移，且与结肠癌患者不良预后有关。

目前，miR-126在结肠癌细胞中具体调控机制尚未阐明。Li等[11]在细胞水平发现，miR-126可通过靶向抑制CXCR4的表达从而抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭转移，但目前仍缺乏miR-126和CXCR4在组织水平的相关证据。因此，本研究通过在结肠癌组织芯片检测miR-126及CXCR4蛋白的表达，对两者的表达进行相关性分析，结果显示miR-126的表达与CXCR4蛋白的表达呈负相关，在组织水平证实miR-126在结肠癌中可能存在对CXCR4的靶向负调控作用。

综上所述，与癌旁正常粘膜组织相比，结肠癌组织中miR-126的表达降低，而CXCR4蛋白的表达升高，二者的表达异常均与结肠癌患者临床分期、有无淋巴结转移明显相关，并显著影响了患者预后。因此，miR-126和CXCR4有可能成为结肠癌诊断、治疗及预后判断的生物标志物。