黎德育，谭 宁，朱辉军，廖康汉，罗晓光，张洁瑶，贺守第

(华中科技大学协和医院中医风湿科，广东 深圳 518060)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫性炎症疾病，约占世界人口的0.24%，约占西方国家总人口的1%，女性发生率是男性的2～3倍[1-3]。RA表现为慢性滑膜炎和关节进行性破坏，白细胞浸润，软骨破坏和骨侵蚀。大约有一半的患者由于这种疾病的进展而致残[4]。RA是一种主要由CD4+T细胞过度表达导致炎细胞因子表达，引起关节破坏。使用胶原(牛或鸡Ⅱ型胶原和佐剂免疫)诱导关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)是常用模型[5]，能模拟CD4+T细胞介导的炎症与广泛的软骨和骨损害，导致关节畸形[6-7]。姜黄素是从姜黄植物中提取的多酚，其具有抗炎和抗菌，改善自身免疫性疾病症状的作用[8-10]。但姜黄素对T细胞的影响目前研究很少，因此本研究的目的是探讨姜黄素对T辅助细胞亚群Th1、Th2、Th17的影响，以及其对免疫性关节炎的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雌性SPF级SD大鼠40只，购自广东省实验动物中心。饲养环境温度(22±2)℃，湿度50%～70%，标准大鼠饲料喂养。

1.1.2 主要试剂

姜黄素(美国sigma公司)；牛Ⅱ型胶原(美国Sigma公司)；完全弗氏佐剂(美国sigma公司)；不完全弗氏佐剂(美国sigma公司)；Anti-Rat CD4 APC、anti-rat-IL-4-PE、anti-rat-IFN-r-FITC、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE、Cell Stimulation Cocktail、Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer、Flow Cytometry Staining Buffer(美国ebiosience公司)；抗大鼠IL-17A、IFN-γ、IL-4血清ELISA试剂盒(美国ebioscience公司)，CCK8试剂(中国碧云天公司)。

1.1.3 仪器与设备

流式细胞仪RACSCAlibur(美国BD biosciences公司)；全波长酶标仪Multiskar(美国Thermo公司)；二氧化碳细胞培养箱INC108(德国memmert公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 关节炎大鼠建模与分组

将40只SD大鼠随机选取8只为正常组。其于32只大鼠分别于第1天尾根部注射Ⅱ型牛胶原与完善弗氏佐剂混合的乳剂150 μL(牛Ⅱ型胶原浓度为2 mg·mL-1)，第10天注射50 μL，第14天通过关节炎评分方法评估双踝关节评分[8]，将关节评分>4分的大鼠24只随机分为模型组、姜黄素A组、姜黄素B组，每组8只。

1.2.2 给药与标本处理

建模第14天，姜黄素A、B组分别腹腔注射25、50 mg·kg-1姜黄素(溶于10%DMSO)，正常组和模型组腹腔注射等体积的含10% DMSO的生理盐水。建模第44天，乙醚麻醉大鼠，心脏取血，收集血清；将大鼠处死后消毒，分离出脾脏，将脾脏充分研磨，加入大鼠淋巴细胞分离液，梯度离心30 min，提取界面层淋巴细胞。

1.2.3 CCK8法检测脾脏淋巴细胞的活性

取分离的淋巴细胞，细胞计数约2×105个加入96孔板中；孵育过夜，加入含20 μg·mL-1的牛Ⅱ型胶原100 μL的培养基，培养72 h，加入20 μL的CCK8试剂，细胞培养箱孵育4 h，读取OD 450 nm值。

1.2.4 流式细胞术检测脾脏淋巴细胞Th1、Th2及Th17细胞比例

取分离淋巴细胞，以1×108个·mL-1加入6孔板；加入cell stimulation cocktail，孵育16 h；取1×107个·管-1的细胞；加入Anti-Rat CD4-APC，4 ℃孵育30 min，洗涤离心，加入IC Fixation Buffer，室温孵育20 min，洗涤后；加入固定/破膜工作液，4 ℃孵育20 min，加入Permeabilization Buffer，室温孵育15 min，分别加入anti-rat-IL-4-PE、anti-rat-IFN-r-FITC，anti-rat -IL-17A-PE,4 ℃孵育30 min，洗涤离心，加入1 mL流式细胞缓冲液，上机检测并分析，应用Flowjo7.61分析数据。

1.2.5 酶联吸附法检测

采用ELISA法检测各组大鼠血清IL-17A、IFN-γ、IL-4水平，具体操作根据试剂盒说明书进行。采用全波长酶标仪(波长为450 nm)检测吸光度值(A450值)，绘制标准化曲线，计算IL-17A、IFN-γ、IL-4含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 关节肿胀评分

模型组、姜黄素A组、姜黄素B组建模第14天，大鼠关节出现关节红肿，第26天关节肿胀最严重。姜黄素干预后，与模型组比较，姜黄素A组、姜黄素B组建模第42、44天关节肿胀评分显著降低(P<0.05或P<0.01)，见图1。

2.2 脾脏淋巴细胞活性

模型组淋巴细胞活性显著高于正常组(P<0.01)，姜黄素A组、姜黄素B组淋巴活性显著低于模型组(P<0.05)，见图2。提示姜黄素能抑制淋巴细胞活性。

2.3 血清IFN-γ、IL-4、IL-17A浓度

模型组血清IFN-γ、IL-17A、IL-4浓度显著高于正常组(P<0.01或P<0.05)。姜黄素A组、姜黄素B组血清IFN-γ、IL-17A浓度显著低于模型组(P<0.01或P<0.05)；而血清IL-4浓度高于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。提示姜黄素能降低IFN-γ、IL-17A浓度，提高IL-4浓度。

2.4 脾脏淋巴细胞Th1、Th2、Th17细胞比例

模型组Th1、Th2、Th17细胞比例显著高于正常组(P<0.01或P<0.05)。姜黄素A组、姜黄素B组Th1、Th17细胞比例显著低于模型组(P<0.01或P<0.05)；而Th2细胞比例高于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。提示姜黄素能降低Th1、Th17细胞比例。

#P<0.05，##P<0.01与正常组比较；*P<0.05，**P<0.01与模型组比较。

图3 血清IFN-γ、IL-4、IL-17A浓度

3 讨论

类风湿关节炎是一种慢性炎症性疾病，其特点是自身免疫、炎症细胞浸润关节滑膜、滑膜增生、新生血管生成、软骨和骨进行性破坏。CD4+T细胞在浸润滑膜组织的炎症细胞中占很大比例。当抗原刺激和细胞因子信号传递时，幼稚的CD4+T细胞激活并分化为各种辅助性细胞亚群。虽然RA的发病机制尚不清楚，传统上干扰素-γ(IFN-γ)产生Th1细胞被认为在RA的发展中起主导作用。但Th1、Th2和Th17细胞作为CD4+细胞的3种重要亚型与RA有关。Th1细胞及其标志细胞因子IFN-γ在RA炎症中起重要作用，抑制Th1反应是RA患者的有效治疗方法。低数量的Th2细胞存在于RA中，在RA中可能具有保护作用,Th2细胞及其细胞因子白介素-4(IL-4)在RA和Ⅱ型牛胶原诱导的关节炎中发挥保护作用。RA患者Th1/Th2比值增高，与疾病活动呈正相关，在疾病中抗风湿药物能够纠正RA中Th1/Th2细胞的失衡。然而，Th1表型并不能解释与RA有关的所有机制。白细胞介素-17(IL-17)产生的Th17细胞的致病作用在类风湿关节炎中起重要作用，因为IL-17是由类风湿滑膜自发产生的，而RA患者外周血单个核细胞中Th17细胞较正常人增加[9]。Th17细胞似乎也在自身免疫性关节炎的发生中起着关键作用[10]。在RA患者和实验性小鼠模型中的各种证据表明Th17细胞及其效应分子在RA的发病机制中起着核心作用[11-12]。

有研究[13]表明姜黄素对多发性硬化、炎症性肠病和1型糖尿病等各种自身免疫性疾病具有治疗效果，可能与调节Treg细胞功能有关。本研究评估了姜黄素对CIA模型的影响，结果表明姜黄素能降低CIA模型关节肿胀的评分。类风湿关节炎是一种以免疫细胞介导的自身免疫免疫性疾病，本研究发现经姜黄素干预后CIA模型的淋巴细胞活性降低，说明姜黄素能抑制CIA的淋巴细胞的活性。进一步的研究发现，不同浓度的姜黄素干预CIA模型后脾细胞中Th1、Th17的比例是下降，而Th2细胞比例轻度上升，同时脾细胞上清液中Th1、Th2、Th17分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的变化与T细胞比例的变化相似，说明姜黄素能通过抑制Th1、Th17的表达改善关节症状，上调Th2细胞比例调节Th1/Th2平衡保护CIA模型，与上述关于Th1、Th2、Th17在类风湿关节炎的作用机制符合。LEE等[14]研究也发现姜黄素能通过抑制小鼠Th1、Th2、Th17反应，减轻Ipex综合征小鼠的免疫功能障碍。

总之，姜黄素通过抑制关节炎大鼠T细胞活性、调节Th1与Th17细胞分化比例及抑制炎症因子产生，改善免疫性关节炎症状。