昌毓穗

(南昌大学第一附属医院急诊科，南昌 330006)

食管癌是一常见的人类恶性肿瘤[1]。全球食管癌患者5年生存率为15%～20%[2-3]。我国食管癌的发病率和死亡率均高于全球平均水平，且存在城乡和性别差异[4]。我国食管癌的组织病理类型仍以鳞状细胞癌占绝大多数[5]。很多食管癌患者就诊于晚期并且预后较差[6]。尽管化疗作为肿瘤手术切除治疗后的辅助治疗方法及晚期食管癌姑息治疗方法并已在临床上广泛应用，但由于肿瘤细胞产生耐药性而严重影响临床化疗效果，且化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞没有选择性的作用，容易导致机体各种脏器损伤，常易使患者难以耐受。因此，对于抗肿瘤新药物及疗效的研究显得很有必要[2,7]。

近年来发现作为内源性激素的心钠素(ANP)在胰腺癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤中具有抗癌作用[8]，且无化疗药物所致的心脏毒性、骨髓抑制及肝肾损害等副作用；另一显著特点是，ANP作为内源性激素在超过生理剂量时对人体正常细胞并无损伤作用[9-10],且食管组织上也存在ANP受体[11]。为探讨ANP对食管鳞癌的抗肿瘤效应，本实验选用食管鳞癌细胞Eca109，通过不同干预措施来研究ANP对食管鳞癌增殖及侵袭性的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与分组

RPMI 1640(北京索莱宝科技有限公司)，胎牛血清(美国Gibico公司)，3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，人alpha-心钠素(美国Phoenix Pharmaceuticals公司)，8-溴环磷酸鸟苷(cGMP，美国Sigma公司)，cGMP抗体(美国Sigma公司)，基质胶(Matrigel Matrix，美国BD公司)，Transwell小室(美国Sigma公司)，RIPA裂解液(南京诺唯赞生物科技有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，兔抗Ras抗体(美国Millipore公司)，鼠抗β-actin单克隆抗体(美国ANBO公司)。食管鳞癌细胞株Eca109购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。本实验完成于南昌大学第一附属医院医学科研中心。

实验设计分为12组：对照组(Control组)，AB组(cGMP抗体浓度为1:80滴度稀释)，ANP10组、ANP1组、ANP0.1组、ANP0.01组(ANP浓度分别为10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)，cGMP10组、cGMP1组、cGMP0.1组、cGMP0.01组(cGMP浓度分别为10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)，ANP1+AB(anti-body,AB)组(ANP浓度为1 μmol·L-1，cGMP抗体浓度为1:80滴度稀释)，cGMP1+AB组(cGMP浓度为1 μmol·L-1，cGMP抗体浓度为1:80滴度稀释)。各组均进行增殖和侵袭实验。检测Control、AB、ANP1、ANP0.1、ANP0.01、ANP1+AB组Ras蛋白的表达。

1.2 MTT法测定

采用MTT法测定心钠素抗食管鳞癌细胞增殖效应。取进入对数生长期的良好食管鳞癌细胞Eca109，将细胞悬液进行染色计数并将活细胞浓度调整为1×104个·mL-1。分别接种于96孔板，并于每板设置空白对照孔，只加培养基。放入37 ℃、5%CO2的孵箱中培养。于第7天行MTT法测定。

1.3 Transwell法检测

采用Transwell法检测心钠素抗食管鳞癌细胞侵袭性。于不同组的Transwell小室中各加入对数期生长良好的食管鳞癌细胞Eca109细胞悬液，然后在小室中依据组别而加入各种浓度的药物试剂。37 ℃，5%CO2条件下进行常规培养24 h。倒置显微镜(×200)下计数移至微孔膜下层的细胞。

1.4 Western Bloting检测

采用Western Bloting检测蛋白表达水平。裂解并提取每组细胞蛋白，BCA法测定各组细胞总蛋白浓度。蛋白变性后上样，再于PAGE胶上电泳，转膜后丽春红染色，再用TBST漂洗。5%脱脂奶粉封闭液中室温下封闭1 h。用Ras蛋白、β-actin一抗4 ℃轻摇孵育过夜。第2天用TBST洗膜3次，每次20 min。结合二抗后用ECL化学发光法检测蛋白质。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS11.5软件对数据进行统计学处理，采用单因素方差分析(ANOVA)及方差齐性分析分别进行各组间的比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANP对食管鳞癌细胞增殖的影响

4种不同浓度ANP组(ANP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)和cGMP组(cGMP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)较其他4组(Control、ANP1+AB、cGMP1+AB、AB组)食管鳞癌细胞增殖均明显减弱(P<0.05)。且其他4组间食管鳞癌细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 ANP对食管鳞癌细胞侵袭力的影响

4种不同浓度ANP组(ANP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)和cGMP组(cGMP10、1、0.1、0.01 μmol·L-1)较其他4组(Control、ANP1+AB、cGMP1+AB、AB组)食管鳞癌细胞侵袭力均明显减弱(P<0.05)，且其他4组间食管鳞癌细胞侵袭力比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3 ANP对食管鳞癌细胞Ras蛋白表达的影响

ANP1和ANP0.1组Ras蛋白的表达较其他4组(Control、AB、ANP0.01、ANP1+AB组)下降(P<0.05)，且其他4组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

*间比较P>0.05，#间比较P>0.05,*与#比较P<0.05,&与*或#比较P>0.05。

图3 ANP对食管鳞癌细胞Ras蛋白表达的影响

3 讨论

近来食管癌成为全球第七位常见肿瘤及第六位肿瘤致死性疾病[12]。我国是世界范围内食管癌高发地区之一，约占全球大概一半左右的病例[13]。选取食管鳞癌细胞作为研究的肿瘤细胞，具有较大和普遍的意义。

MTT法具有较高敏感性和可靠性[14]。本研究结果显示，ANP能够抑制食管鳞癌细胞的增殖，具有抑癌作用。侵袭和转移是恶性肿瘤的又一个重要恶性生物学特征。肿瘤细胞浸润周围组织及转移生长的机制相当复杂，涉及到一系列分子和细胞间以及细胞与细胞外基质的相互作用[15]。其中重要的步骤之一就是先降解周围组织的细胞外基质。BD Matrigel胶的基质是从富含细胞外基质的engelbreth-holm-swarm(EHS)鼠肉瘤中提取出来的，成分与人体细胞外基质相类似，是肿瘤侵袭性研究的基本物质，能很好地模拟肿瘤细胞在体内的恶性生物学行为过程。本文结果表明，不同浓度的心钠素能降低食管癌细胞的迁移，从而抑制食管鳞癌细胞的侵袭力。

研发肿瘤靶向治疗药物已成为提高肿瘤患者生存率的一个受关注的研究方向[7]。ANP是主要由心房细胞分泌的一种内源性活性激素肽，高于生理剂量的ANP对肺癌等多种肿瘤具有较明显的抗肿瘤作用，并且对正常细胞却没有明显的毒副作用[8-9]。这使得ANP成为一种很有开发前景的抗肿瘤药物。

8-溴环磷酸鸟苷是cGMP的类似衍生物，具有良好的细胞通透特性，能较好地进入细胞，从而模拟cGMP的作用，因此被用于多种肿瘤的研究中[16]。实验结果显示ANP和cGMP对食管鳞癌细胞都具有抗肿瘤作用，能抑制其增殖和侵袭力。但当cGMP抗体与ANP或与cGMP一起时，对两者的抗肿瘤作用均可起到对抗作用；同时，cGMP抗体自身对食管鳞癌细胞的增殖和侵袭力无影响。而cGMP抗体是cGMP的特异性抗体，在体内仅与cGMP相作用，因此推断，cGMP抗体对抗ANP的抗肿瘤效应是拮抗细胞内cGMP的结果，ANP对食管鳞癌细胞增殖和侵袭力的抑制作用是由cGMP介导的。

本文蛋白表达实验结果显示，不同浓度ANP对Ras蛋白均有抑制作用；当ANP加cGMP抗体一起作用于食管鳞癌细胞时，这种对Ras的抑制作用消失；同时，单独用cGMP抗体时对食管鳞癌细胞中的Ras蛋白无抑制作用。由于cGMP抗体是cGMP的特异性抗体，可阻断cGMP的生物学作用，由此可推论，在cGMP抗体与ANP一起时，由于cGMP抗体阻断了ANP上调食管鳞癌细胞中cGMP的效应，从而导致ANP对Ras蛋白表达的抑制作用消失。因此，ANP通过cGMP介导而抑制Ras蛋白的表达，进而产生抗癌作用。

总之，ANP通过cGMP介导抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭力，并下调食管鳞癌中Ras的表达,从而产生拮抗食管鳞癌作用。