王慧娟，吴正奇，黄梦萍，叶文祥，万端极，*

（1.湖北工业大学土木建筑与环境学院，湖北武汉430068；2.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430068）

牡丹属芍药科落叶灌木，也是中国著名的观赏华卉[1]。牡丹籽含油率在24%～37.8%左右[2]，其中不饱和脂肪酸含量超过90%，亚麻酸约占到45%[3-4]，而不饱和脂肪酸可降低冠心病风险[5]。牡丹籽油相较亚麻籽油，γ-生育酚、角鲨烯、甾醇含量更高[6]，而它们均具有良好的抗氧化作用。研究表明，牡丹籽油具有良好的抗氧化[7]、降血脂[8]、抗糖尿病[9]、防晒作用[10]，无毒食用安全[11]，高温煎炸10次仍符合国家植物油卫生标准[12]。据不完全统计，我国油用牡丹种植面积约有2万hm2，牡丹籽油加工企业9个[13]，其中，菏泽尧舜牡丹生物科技有限公司采用超临界CO2萃取技术，已建成国内最大的牡丹籽油生产线[14]。

目前，工业中提取植物油的方法主要为压榨法和溶剂法。水酶法作为新兴的提油方法，因其提油率高、提取条件温和、没有引入其他溶剂、提油的同时可以得到水解蛋白，近年来受到颇多关注。现阶段牡丹籽油的水酶法工艺存在的主要困难是形成较厚的乳化层，限制了油脂的游离。Rosenthal等[15]指出乳化层的破乳取油为水酶法的一大技术难点。本试验采用乙醇预处理水酶法提取牡丹籽油，利用乙醇的破乳作用，研究乙醇预处理阶段中料液比、乙醇浓度、反应温度、反应时间对游离油提取率的影响，从而确定了乙醇预处理的最佳提油工艺条件，以期为牡丹籽油的工业化应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡丹籽仁：产自山西；碱性蛋白酶（20万U/g）：庞博生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯。

HH-601电热恒温水浴锅：上海伟业仪器厂；320-S pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；101A-1型电热鼓风干燥箱：南京恒星实验设备有限公司；EX223ZH电子精密天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；DK-98-Ⅱ电子万用炉、SX-10-12型箱式电阻炉控制箱、FW177中草药粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；K1100F全自动凯式定氮仪、SH420F石墨消解仪：武汉海能科学仪器有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 提取方法及操作要点

牡丹籽仁→筛选→干燥→粉碎→过筛（40目）→乙醇预处理→离心→渣相→加水碱提→酶解→离心→牡丹籽游离油

选用新鲜牡丹籽仁，剔除未完全去壳部分，余下部分在65℃的烘箱中干燥至恒重，然后用中草药粉碎机粉碎（注意防止粉碎机温度过高造成油脂氧化）后过40目筛，准确称取牡丹籽粉与一定浓度的乙醇溶液按一定的料液比混合，在一定的温度下反应一定时间后离心（3 000 r/min），得上清液和渣相；上清液即乙醇提取液，渣相按1∶3（g/mL）的料液比加水混匀，在pH 10.0、温度为35℃下碱提1 h，然后将混合液的温度和pH值调节为碱性蛋白酶最适条件，加入15%的酶量（酶/底物·干基计）酶解5 h后离心（3 000 r/min），取上层清油即为牡丹籽游离油，测定游离油提取率。

1.2.2 单因素试验

按照1.2.1的工艺，研究乙醇溶液料液比、乙醇浓度、反应温度、反应时间对游离油提取率的影响。

1.2.2.1 料液比对游离油提取率的影响

牡丹籽粉与70%的乙醇溶液分别按1∶6、1∶7、1∶8、1 ∶9、1 ∶10（g/mL）的料液比混合，在 25 ℃下反应5 h后离心，所得渣相按照1.2.1的工艺条件碱提、酶解、离心，取上层清油称重，计算游离油提取率。

1.2.2.2 乙醇浓度对游离油提取率的影响

牡丹籽粉分别与70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，在25℃下反应5 h后离心，所得渣相按照1.2.1的工艺条件碱提、酶解、离心，取上层清油称重，计算游离油提取率。

1.2.2.3 反应温度对游离油提取率的影响

牡丹籽粉与80%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，混合液分别在 15、25、35、45、55℃下反应5 h后离心，所得渣相按照1.2.1的工艺条件碱提、酶解、离心，取上层清油称重，计算游离油提取率。

1.2.2.4 反应时间对游离油提取率的影响

牡丹籽粉与80%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，混合液在 35 ℃下分别反应 4、5、6、7、8 h 后离心，所得渣相按照1.2.1的工艺条件碱提、酶解、离心后，取上层清油称重，计算游离油提取率。

1.2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，对乙醇预处理阶段中的料液比、乙醇浓度、反应温度、反应时间4个因素进行正交试验。每个因素选取3个显著水平，以游离油提取率为指标，进行L9（34）乙醇预处理条件的正交试验，因素水平表见表1。

表1 乙醇预处理条件的正交试验设计表Table 1 Orthogonal experiment design of ethanol pretreatment conditions

1.3 分析方法

1.3.1 牡丹籽主要成分的分析

水分按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》执行；脂肪按照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》执行；蛋白质按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法执行；灰分按照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》执行。

1.3.2 牡丹籽游离油提取率的计算

式中：m为游离油质量，g；M为干燥牡丹籽质量，g；α为牡丹籽中脂肪的质量分数，%。

2 结果与分析

2.1 牡丹籽仁主要成分及含量

牡丹籽仁主要成分及含量见表2。

表2 牡丹籽仁主要成分及含量Table 2 Main components and content of peony seed kernel %

由表2可知，牡丹籽仁富含脂肪和蛋白质，而在水酶法工艺中蛋白质的乳化性会束缚油脂的游离。

2.2 单因素试验

水酶法提取牡丹籽油，由于在水相体系中反应，牡丹籽自身磷脂、蛋白质、脂肪酸、小分子糖等物质会影响油脂的游离。其中，磷脂和蛋白质是良好的乳化剂，脂肪酸在碱性环境下生成表面活性剂脂肪酸钠，而大量小分子糖的存在也会增加蛋白质的乳化性[16]。并且乙醇作为一种毒性较小、价格低廉、广泛应用于工业化生产中的有机溶剂，一定浓度的乙醇溶液既可以使牡丹籽粉中磷脂、脂肪酸、小分子糖等物质溶出，又可以通过降低牡丹籽蛋白质的溶解性，防止由于较长时间的反应而形成的顽固乳化层。此外由于油脂不溶于极性溶剂乙醇，因而采用乙醇预处理水酶法提取牡丹籽油是对牡丹籽油没有损失的。

2.2.1 料液比对游离油提取率的影响

料液比对游离油提取率的影响见图1。

图1 料液比对游离油提取率的影响Fig.1 The influence of solid-liquid ratio on extraction rate of free oil

由图 1可知，料液比在 1∶6（g/mL）～1∶8（g/mL）间，随着料液比的增大游离油提取率增加很快，当料液比超过1∶8（g/mL）时，提取率变化不大。分析原因可能为，一定范围内增加溶剂用量，使得牡丹籽粉内磷脂、脂肪酸、小分子糖等物质溶出增加，从而致使后续渣相碱提、酶解液内起乳化作用的物质减少，利于油脂游离，但当料液比达到一定程度时，牡丹籽粉中的磷脂、脂肪酸、小分子糖在乙醇中的溶解已比较充分，继续增大料液比对游离油提取率没有改善，同时考虑成本，选择最佳料液比为1∶8（g/mL）。

2.2.2 乙醇浓度对游离油提取率的影响

乙醇浓度对游离油提取率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对游离油提取率的影响Fig.2 The influence of ethanol concentration on extraction rate of free oil

由图2可知，游离油提取率随乙醇浓度的增加逐渐增加，当乙醇浓度达到80%时游离油提取率最高。分析原因可能为乙醇浓度越大，牡丹籽粉中磷脂、小分子糖、脂肪酸等物质的溶出越充分，那么这些物质残留在渣相中的量就越少，利于渣相在碱提酶解过程中油脂的游离。但过高的乙醇浓度，游离油提取率反而降低，这是因为水对物料的溶胀作用，该作用能增大物料与溶剂的接触面积[17]，较高的乙醇浓度含水量较少，牡丹籽粉溶胀不充分，从而使得磷脂、小分子糖、脂肪酸的溶出不充分，反而较多的残留在渣相，最终导致游离油提取率降低。因此，最佳乙醇浓度为80%。

2.2.3 反应温度对游离油提取率的影响

反应温度对游离油提取率的影响见图3。

由图3可知，游离油提取率随乙醇溶液温度升高，呈现先增加后减少的趋势，在35℃时提取率最高。分析原因可能为，温度升高磷脂、小分子糖、脂肪酸在乙醇溶液中的溶解增加，但当温度超过35℃，由于卵磷脂在乙醇中的溶解过程是放热反应，温度升高卵磷脂溶解度降低[18]，因而渣相残留的卵磷脂增多，导致在碱提酶解阶段较多的油脂被束缚无法游离。因此最佳温度为35℃。

图3 反应温度对游离油提取率的影响Fig.3 The influence of temperature on extraction rate of free oil

2.2.4 反应时间对游离油提取率的影响

反应时间对游离油提取率的影响见图4。

图4 反应时间对游离油提取率的影响Fig.4 The influence of time on extraction rate of free oil

由图4可知，随着反应时间的延长，游离油提取率越来越大，超过7 h后提取率增长不显著。分析原因可能为，维持提取过程进行的推动力是有效成分的浓度差，提取开始时，固液浓度差很大，扩散推动力大，磷脂、小分子糖、脂肪酸的溶出逐渐增加，这些物质在渣相中的含量逐渐越少，从而促使游离油提取率增加；但是随着时间的延长，渣相和乙醇提取液两相中磷脂、小分子糖、脂肪酸等物质的浓度达到或接近平衡，游离油提取率也基本维持稳定。因此，最佳反应时间为7 h。

2.3 乙醇预处理条件的正交试验

根据单因素试验情况，以游离油提取率为指标，对主要影响因素乙醇溶液料液比（A）、乙醇浓度（B）、反应温度（C）、反应时间（D）4个因素每个因素选取3个显著水平进行L9（34）的正交试验，试验结果见表3。

由表3的极差分析可知，在乙醇预处理阶段中各因素对牡丹籽游离油提取率的影响依次为乙醇浓度＞反应温度＞料液比＞反应时间，最佳提取条件为A2B2C2D2，即料液比为 1 ∶8（g/mL）、乙醇浓度为 80%、乙醇溶液温度为35℃、处理时间7 h。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal experiment results

2.4 优化工艺重复性考察

为验证水酶法提取牡丹籽油的最佳乙醇预处理工艺条件，准确称取50、100、200 g的牡丹籽粉3份分别与80%乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，在35℃下反应7 h后离心，所得渣相按1.2.1的具体工艺碱提、酶解、离心。3份牡丹籽样品的游离油提取率依次为90.29%、90.34%、90.31%，平均值为90.31%。经测定所制备的牡丹籽油中乙醇残留符合牡丹籽油行业标准，即小于10 mg/kg。因此，该提取条件合理、重复性好。

3 结论

本研究采用乙醇预处理水酶法提取牡丹籽油，在本课题前期研究所得牡丹籽最佳碱提、酶解条件的基础上，通过单因素试验和正交试验优化了乙醇预处理的工艺条件，所得最佳提取牡丹籽油工艺条件为：乙醇溶液料液比为1∶8（g/mL）、浓度为80%、反应温度为35℃、反应时间为7 h。在此条件下，游离油提取率高达90.31%，且该工艺重复性较好，溶剂残留符合牡丹籽油行业标准，与传统的水酶法工艺相比，此方法游离油提取率得到了较大的提升。值得注意的是，申少斐[19]等发现牡丹籽仁中低聚芪类物质含量较高，刘普[20]等发现在油用牡丹脱壳饼粕中单萜苷类物质的含量远大于其在牡丹籽壳中的含量，其中，芍药苷的含量最高。同时，现已有研究使用70%左右的乙醇溶液从牡丹籽中提取低聚芪类[19]和芍药苷[21]，并获得了较高的提取率。因此，采用乙醇预处理水酶法提取牡丹籽油工艺，通过不断地试验，有望实现可以同时得到活性物质、油脂和水解蛋白，从而进一步实现牡丹籽的综合开发。