唐婷范，黄芳丽，朱家庆，程昊，黄青勇，李晓慧，梁杰婷，田玉红，*

（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州545006）

葛根（Pueraria lobata）又名野葛，是多年生落叶藤本豆科植物。我国拥有丰富的葛根资源，栽培种类繁多，种植历史悠久[1]。葛根含有丰富的活性成分，异黄酮是葛根的主要活性成分，约占葛根总量的5%～10%[2]，其具有改善血液循环、降低血压、软化血管、增强血液循环功能、预防癌症等功效，临床上用于治疗心绞痛、高血压、偏头痛等[3-4]。在食品工业、日用、保健、医药等领域具有重要的作用，因此进行葛根的异黄酮提取工艺优化及其抑菌作用研究具有重要意义[5-7]。目前最常用的提取葛根异黄酮的方法是乙醇加热回流法，但该法加热时间长，杂质溶出物较多，与乙醇加热回流提取法相比，超声波辅助提取法具有工艺简单、无需加热、提取快速、提取率高等特点。超声技术已广泛地得到应用，很多研究表明，利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响[8-13]。

为克服传统提取法加热时间长杂质溶出物较多等缺点，本试验以葛根为原材料，采用超声波辅助法提葛根取异黄酮，考察乙醇浓度、超声功率、提取温度、液料比以及提取时间对异黄酮提取得率的影响；并选用响应面分析方法优化异黄酮提取工艺，以期确定超声波辅助提取葛根异黄酮的最佳工艺条件。同时采用4种不同的菌对所提取的异黄酮进行初步的抑菌研究，旨在为更好地开发利用葛根资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根，选用广西贵港野葛；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉、黑曲霉：广西科技大学生物与化学工程学院提供；无水乙醇为分析纯；葛根素为标准品。

1.2 仪器与设备

GZX-GF101-4-S型电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；DFY-600C型摇摆式高速粉碎机：浙江省温岭市大机械有限公司；TU-1950型紫外-可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；TDL-80-2B型低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；AR124CN型电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHZ-95B型循环水式真空抽滤机：河南予华仪器有限公司；RE-52A型真空旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；RE-52AZSD-1270型立式压力蒸汽灭菌器：上海智城分析仪器制造有限公司；LRH-250-A型生化培养箱：韶关市泰宏医疗器械有限公司。

2 试验方法

2.1 葛根异黄酮的提取工艺优化

2.1.1 葛根的预处理

选择新鲜无虫害品质良好的野葛根，将其清洗干净，去皮，切片，然后用烘箱低温（40℃）烘干；烘干好的葛根用粉碎机进行粉碎、过40目筛，然后将粉末密封保存，备用。

2.1.2 标准曲线的绘制

准确称取葛根素标准品5 mg，用95%乙醇溶解后，用25 mL容量瓶定容，摇匀，得到0.2 mg/mL葛根标准液。分别移取5.0 mL离心后的葛根提取液和2.0 mL葛根素标准液至10 mL具塞试管中，用95%的乙醇定容到刻度，摇匀，以95%乙醇为空白，用紫外-可见光光度计在200 nm～500 nm的波长范围内进行光谱扫描，确定吸收波长。分别精密吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL 葛根标准溶液于 25 mL 容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀。用紫外-可见光分光光度计进行测定吸光值。以葛根素浓度（C）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标建立标准曲线[14]。

2.1.3 葛根异黄酮的测定

准确称取2 g预处理好的葛根粉，置于150 mL带塞锥形瓶中按一定的液料比加入不同浓度的乙醇溶液进行溶解，充分溶解后放入超声波清洗机中，在一定的温度、超声功率下超声波辅助提取一定时间，提取完成后趁热进行真空抽滤，然后吸取10mL滤液到100mL容量瓶中，用95%的乙醇定容到刻度线，摇匀，用离心机以3 000 r/min离心10 min，从上清液中吸取2.5 mL到50 mL容量瓶中，并用95%的乙醇稀释到刻度。然后在波长250 nm处进行异黄酮的测定，代入标准曲线回归方程计算出异黄酮的含量，并按公式1计算出异黄酮的得率。

式中：C为提取液异黄酮的浓度，μg/mL；V为提取液的体积，mL；m为提取样质量，g。

2.1.4 单因素试验

2.1.4.1 乙醇浓度的考察

准确称2 g预处理好的葛根粉，在超声功率300W、提取温度50℃、液料比20∶1（mL/g）、提取时间30 min的条件下，取乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%和90%6个水平进行超声波辅助提取试验，每个水平做3个平行。

2.1.4.2 超声功率的考察

准确称取2 g预处理好的葛根粉，在乙醇浓度为60%、提取温度 50℃、液料比 20∶1（mL/g）、提取时间30 min 的条件下，取超声功率为 200、250、300、350、400 W 5个水平进行超声波辅助提取试验，每个水平做3个平行。

2.1.4.3 提取温度的考察

准确称取2 g预处理好的葛根粉，在乙醇浓度为60%、超声功率 300 W、液料比 20∶1（mL/g）、提取时间30 min 的条件下，取温度为 30、40、50、60、70 ℃ 5 个水平进行超声波辅助提取试验，每个水平做3个平行。

2.1.4.4 液料比的考察

准确称取2 g预处理好的葛根粉，在乙醇浓度为60%、超声功率300 W、提取温度50℃、提取时间30 min 的条件下，取液料比为 10∶1、15∶1、20 ∶1、25∶1、30∶1（mL/g）5个水平进行超声波辅助提取试验，每个水平做3个平行。

2.1.4.5 提取时间的考察

准确称取2 g预处理好的葛根粉，在乙醇浓度为60%、超声功率300 W、提取温度50℃、液料比20 ∶1（mL/g）的条件下，取提取时间为 10、20、30、40、50、60、70、80 min 8个水平进行超声波辅助提取试验，每个水平做3个平行。

2.1.5 响应面试验

在单因素试验结果基础上，选液料比（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）3个因素为自变量，以异黄酮得率为指标，结合 Design Expert 8.0.6软件和Box-Behnken设计法[15-17]，建立三因素三水平上响应面试验，对超声提取异黄酮的工艺条件进行优化。试验因素及水平见下表1，其中1、0、-1分别代表自变量中的高水平、中水平和低水平。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码Table 1 Factor level and coded of Box-Behnken design

2.2 抑菌试验

2.2.1 原料异黄酮的制备

称取经预处理后葛根粉200.0 g，进行提取后，用真空抽滤机进行抽滤，过滤所得滤液再用旋转蒸发仪在40℃蒸发浓缩，最后用干燥箱在60℃下干燥所得。

2.2.2 抑菌试验方法

将葛根异黄酮配成 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 溶液，采用滤纸片法[18]：以无菌水做空白对照，5%苯甲酸钠为阳性对照，分别放入直径6 mm的无菌滤纸片浸泡2 h，取出滤纸片沥干表面水分。在无菌环境下将培养基冷却至40℃～50℃后倒入各灭菌好的平板中，每平板约20 mL，静置冷却至凝固。将4种活化好的菌悬液（细菌菌落数约为107CFU/mL～108CFU/mL[19]，霉菌孢子数约为106个/mL～107个/mL）。分别用移液枪吸取0.1 mL放到不同的培养基上，用灭菌过的玻璃涂棒涂布均匀，并对其进行编号区分。用镊子夹取5种浸泡后沥干的滤纸片放置在4种含菌培养皿中，每个培养皿放3片，呈三角形排布，每次夹取滤纸片前镊子要经火焰灼烧灭菌。处理好后的培养皿放到适宜的环境下培养：细菌在37℃条件下培养18 h～24 h、霉菌在28℃条件下培养48 h。取出测量各个抑菌圈的直径，记录并判断不同浓度对不同菌种的抑制效果。

2.3 数据处理

各指标重复测定3次，取平均值。使用Origin 8进行数据记录、初步处理和绘制图表；采用spss 17软件进行单因素方差分析，采用Design Expert 8.0.6进行Box-Bnheken试验设计、试验数据处理、分析及绘图。

3 结果与分析

3.1 葛根异黄酮标准曲线

葛根异黄酮与葛根素的紫外吸收光谱如图1所示。

图1 葛根异黄酮与葛根素的紫外吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Pueraria isoflavones and Puerarin

由图1表明，在波长250 nm处葛根异黄酮和葛根素标准液的均有最大吸收峰，故试验选定的测定波长为250 nm。在250 nm处测量吸光值，以葛根素浓度（C）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 葛根素标准曲线Fig.2 Standard curve of Puerarin

得到标准曲线方程为：y=0.067 x-0.004 5（R2=0.999 3），葛根素在 1.6 μg/mL～12 μg/mL 浓度范围内浓度和吸光度有良好的线性关系。

精准移取25 mL同一样品溶液5份，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 葛根素标准液，在波长 250 nm处测定各样液的吸光度，根据回收率=（实际测值-样液异黄酮含量）/葛根素加入量×100%计算，结果见表2。

表2 加标回收率试验结果（n=5）Table 2 Results of recovery experiments（n=5）

由表2得知，平均加标回收率为98.73%，RSD为2.04%，表明此方法可用于测定葛根异黄酮的含量。

3.2 单因素对葛根异黄酮提取得率的影响

3.2.1 乙醇浓度对葛根异黄酮提取得率的影响

乙醇浓度对异黄酮提取得率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对异黄酮提取得率的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of isoflavones

由图3可知，葛根异黄酮得率随着乙醇浓度的增大先升高后降低，在乙醇浓度为60%时提取得率最大，形成此趋势主要是葛根含有的异黄酮种类非常多，多数异黄酮不易溶于水，而且不同的异黄酮单体之间极性不同[20]。故最佳的乙醇浓度为60%。

3.2.2 超声功率对葛根异黄酮提取得率的影响

超声功率对异黄酮提取得率的影响见图4。

图4 超声功率对异黄酮提取得率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic power on extraction of isoflavones

由图4可知，葛根异黄酮得率随着超声功率增加而增加，当提取功率大于300 W时异黄酮得率开始缓慢下降。可能原因是功率较大时，超声波及剪切力作用下，使葛根异黄酮的结构遭到破坏，造成异黄酮得率下降[21-22]。故本试验选择超声功率300 W为研究对象。

3.2.3 提取温度对葛根异黄酮提取得率的影响

提取温度对异黄酮提取得率的影响见图5。

图5 提取温度对异黄酮提取得率的影响Fig.5 Effects of ultrasonic temperature on extraction of isoflavones

由图5可以看出，在温度50℃前葛根异黄酮提取得率随温度升高而升高，当温度达到50℃以后，异黄酮得率开始下降，原因可能是高温时会破坏异黄酮母核的结构，从而提取得率下降[23]。因此提取温度选50℃为宜。

3.2.4 液料比对葛根异黄酮提取得率的影响

液料比对异黄酮提取得率的影响见图6。

图6 液料比对异黄酮提取得率的影响Fig.6 Effects of ratio of solid to liquid on extraction of isoflavones

由图6可知，随着液料比的增大异黄酮得率先升高后下降，在液料比20∶1（mL/g）时异黄酮得率出现最大值。可能原因是溶剂量的增加使原料颗粒周围有效成分的浓度降低，从而有利于异黄酮向提取液扩散，但液料比太大，溶剂挥发增加了异黄酮的损失，同时也提高杂质成分的溶出，导致异黄酮提取得率下降[24]。故液料比选 20 ∶1（mL/g）最佳。

3.2.5 提取时间对葛根总异黄酮提取效果的影响

提取时间对异黄酮提取得率的影响见图7。

图7 提取时间对异黄酮提取得率的影响Fig.7 Effects of ultrasonic extraction time on extraction of isoflavones

由图7可知，在前60 min内异黄酮得率随着提取时间的增加而增高，之后明显趋缓甚至下降，可能的原因是异黄酮类物质长期处于高温环境下容易被氧化[22]，并且长时间提取会溶出大量的非异黄酮杂质[25]。故选择提时间以60 min为宜。

3.3 响应面法优化超声波提取葛根异黄酮的工艺条件

3.3.1 异黄酮提取工艺回归模型的建立及方差分析

Design Expert 8.0.6软件和Box-Behnken建立的17个试验方案按2.1.5方法进行试验分析，设计方案及试验结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计方案及试验结果Table 3 Box-Behnken design matrix and response value for the yield of isoflavones

应用Design Expert 8.0.6软件，对表3中的试验数据进行二次回归方程拟合响应值与因素之间函数关系，得出异黄酮得率（Y）与液料比（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）的二次多项回归方程：

Y=2.12＋0.010A-0.020B-0.010C-0.010AB＋0.015AC＋0.000BC-0.089A2-0.086B2-0.066C2。对所建的回归模型进行方差分析，结果如表4所示。

表4 回归模型方差分析结果Table 4 ANOVA for the response surface quadratic isoflavones model

由表4可知，所建立的模型具有极高显著性（P＜0.000 1），一次项 B 具有显著性，二次项 A2、B2、C2极显著，其余项均不显著，失拟项不显著（P=0.774 4），由F值知，各因素对葛根异黄酮得率的影响主次顺序为：乙醇浓度（B）＞液料比（A）＞提取温度（C），模型的相关系数R2=0.986 1，校正确定系数Radj2=0.968 3，说明回归方程的拟合度有较高的可信度，误差小，可用此模型对葛根异黄酮提取进行预测和分析。

3.3.2 异黄酮得率响应面分析

采用Design Expert 8.0.6软件，绘制出交互作用AB、AC、BC的3D曲面图，可以直观看出3个因素和响应值之间的交互影响情况，结果如图8～图10所示。响应曲面坡度陡峭，说明响应值容易受到影响，坡度平缓，说明其响应值不容易受到影响[26]。

由图8可知，曲面坡度相对陡，说明料液比和乙醇浓度的交互影响显著。同理由图9和图10可知，它们的曲面坡度相对也陡，说明料液比和提取温度、乙醇浓度和提取温度的交互影响显著。

3.3.3 响应面优化结果及验证分析

图8 液料比和乙醇浓度对异黄酮得率的响应面图Fig.8 Response surface diagram of the ratio of liquid to solid and the ethanol concentration to the yield of isoflavones

图9 液料比和提取温度对异黄酮得率的响应面图Fig.9 Response surface diagram of the ratio of liquid to solid and the temperature on extraction to the yield of isoflavones

图10 乙醇浓度和提取温度对异黄酮得率的响应面图Fig.10 Response surface diagram of the ethanol concentration and the temperature on extraction to the yield of isoflavones

根据模型进一步回归分析，预测出的最佳的提取工艺参数：液料比为20.30∶1（mL/g）、乙醇浓度为58.81%、提取温度为49.34℃，此条件下异黄酮得率理论值为2.12%。考虑到实际操作，将提取异黄酮工艺参数修正为：液料比为20∶1（mL/g）、乙醇浓度为60%、提取温度为50℃。按照此修正工艺参数进行3次试验验证，得出平均得率为2.11%，与理论值相对误差为0.47%，说明此工艺稳定可行。

3.4 葛根异黄酮抑菌效果

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和青霉对不同浓度的葛根异黄酮的抑菌效果见表5。

表5 不同浓度葛根异黄酮的抑菌效果Table 5 Antibacterial effects of different concentrations of isoflavones

从表5可以看出葛根异黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有不同程度的抑制效果，异黄酮浓度在0.5mg/mL时对大肠杆菌开始有抑菌作用，异黄酮浓度在1.0 mg/mL时对枯草芽孢杆菌开始有抑菌作用。在一定浓度范围内随着葛根异黄酮的浓度增加抑菌效果更明显，在同一浓度中大肠杆菌抑菌效果大于枯草芽孢杆菌的抑菌效果；而对青霉和黑曲霉则无抑菌效果。

4 结论

根据单因素试验及响应面法优化葛根异黄酮提取条件，得出超声波辅助法提取异黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，超声功率300 W，提取温度50 ℃，液料比 20 ∶1（mL/g），提取时间 60 min，在此条件下异黄酮提取得率可达2.11%，理论值相对误差为0.47%，且各因素对异黄酮提取得率的影响依次为：乙醇浓度（B）＞液料比（A）＞提取温度（C），模型的相关系数R2=0.986 1，此提取工艺条件合理可行。与传统提取工艺相比，该提取工艺时间短。本试验采用超声波辅助提取的葛根异黄酮对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定抑菌效果，在试验浓度范围内，抑菌作用随浓度增大而增强，说明葛根异黄酮是一种具有抑菌活性的物质，可作为一种天然的防腐剂。