陈金玉，曲金萍，张坤生，闫怡君，任云霞

（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

苦荞麦又被称为三角麦，是一种粮药兼备的资源[1]。苦荞麦最早起源于中国，在中国各地均有种植，其面积和产量居世界第二位。荞麦尤其是苦荞麦，在所有粮食作物中，不仅具有较高的营养价值，还含有其他粮食作物所缺少的药用成分和特种微量元素。苦荞麦含有多种生物活性成分，具有较高的营养价值和保健功能，对绝大多数中老年心脑血管和现代“文明病”均有预防和治疗作用[2]。

已有文献报道，苦荞蛋白具有一系列显著的生理功效，如降低胆固醇、改善便秘、调节血糖和血脂、抑制脂肪蓄积和预防肿瘤等[3]，而这些保健功效很可能与苦荞蛋白的消化特性有关[4]。苦荞蛋白的氨基酸组成比较均衡，约含有17种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸。在这8种必需氨基酸中，除亮氨酸外，剩余大多数氨基酸含量都高于小麦粉和玉米，尤其以一般植物缺乏的赖氨酸和精氨酸最为丰富，这两种氨基酸恰恰是组成人体血液即血浆蛋白的主要成分[5-6]。苦荞蛋白的制备方法主要有碱溶酸沉法[7]、乙醇提取法、酶解法等。研究表明，蛋白水解得到的多肽具有一系列显著的生理生物活性，如抗氧化[8]、降血压、抗凝血、抗肿瘤、抗菌、提高免疫力等[9]，因此研究苦荞蛋白水解产物对于进一步开发苦荞新功能产品具有潜在的市场价值和应用前景[10]。

本文以DPPH自由基清除能力为评价指标，筛选酶法制备苦荞蛋白抗氧化肽的最适酶。在此基础上，以水解度为指标，利用单因素和响应面模型分析法优化酶解工艺条件，而后进一步利用超滤法、凝胶过滤色谱法对苦荞蛋白水解物进行分离纯化，考察不同级份的抗氧化活性。试验结果为深入探究苦荞蛋白水解物的抗氧化活性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石油醚（30℃～60℃沸程）：天津市风船化学试剂科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）：上海麦克林生化试剂有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、牛血清蛋白：Sigma试剂公司；葡聚糖凝胶（G-15）：北京索莱宝试剂有限公司。

SHB-Ⅲ循环水式真空泵：巩义市毛华仪器有限公司；BECKMAN COULTER离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；FD-A-50冷冻干燥机：上海皓庄仪器有限公司；IKA T10高速组织匀浆机：艾卡（广州）仪器设备有限公司；A2004A电子天平：上海精天仪器有限公司；HITACHI U-5100型分光光度计：日立高新技术公司；EL20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；超滤离心管：美国Millipore有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦荞蛋白的提取

参考李宗杰[11]的方法，将苦荞麦粉按料液比1∶2（g/mL）加入30℃～60℃沸程的石油醚中，置于通风橱中不断搅拌，待大部分石油醚挥发后，用布氏漏斗过滤，并在通风橱中晾干，得到脱脂荞麦粉。将干燥的脱脂荞麦粉与蒸馏水按1∶10（g/mL）混合，调节pH值为8.0，在 50℃下水浴 30min。离心（9000r/min）20min，收集上清液并调节pH值为4.5（苦荞蛋白等电点约为4.5），再次离心得到沉淀。沉淀物用去离子水多次冲洗后调节其pH值为7.0，真空冷冻干燥，即为苦荞蛋白。

1.2.2 水解产物的制备

称取适量苦荞蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液（pH 7）中，样品浓度为2%，匀浆30 s，调节pH值，加入一定量酶进行水解。结束后，将酶解液置于沸水中灭酶10 min，冷却至室温（25℃），调节反应液pH值为4.5，离心（5 500 r/min）15 min，取上清液，真空冷冻干燥得到酶解产物粉末。

1.2.3 蛋白酶的筛选

分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶对提取的苦荞蛋白进行水解，以抗氧化活性为指标筛选最佳用酶。各酶水解的条件见表1。

表1 各酶较适宜的水解条件[12]Table 1 The suitable hydrolysis conditions of each enzyme[12]

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 时间对苦荞蛋白水解度的影响

以1.2.3中筛选的酶为最适酶进行水解，酶与底物添加质量比为1∶50，调节反应体系pH值至2.0，置于37℃恒温水浴锅中水解 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，迅速放入沸水浴中灭酶10 min，考察反应时间对水解度的影响。

1.2.4.2 温度对苦荞蛋白水解度的影响

选择1.2.4.1中筛选的最佳反应时间，调节pH值至2.0，酶与底物添加质量比为1∶50，分别置于23、30、37、44、51℃水浴锅中水解2.0 h，反应结束后沸水浴灭酶，考察温度对水解度的影响。

1.2.4.3 pH值对苦荞蛋白水解度的影响

选择1.2.4.1和1.2.4.2中筛选的最佳反应时间和温度，酶与底物添加质量比为1∶50，调节pH值分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，置于 37 ℃恒温水浴锅中酶解2.0 h，反应结束后沸水浴灭酶，考察pH值对水解度的影响。

1.2.5 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken设计原理，以水解度值为响应指标，以pH值、温度和时间为响应因子，进行三因素三水平响应面试验设计，确定苦荞蛋白多肽制备的最佳工艺条件。试验因素水平表见表2。

表2 响应面试验因素水平编码表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 水解度的测定

将水解液与等体积20%三氯乙酸溶液混合，离心（1 600 r/min）30 min，取上清液 1 mL于试管中，加入4 mL双缩脲试剂，剧烈振荡后，放置30 min，于波长540 nm测定吸光度值。以牛血清蛋白为标准蛋白质[13]。苦荞蛋白的水解度计算公式如下：

水解度/%=上清液蛋白浓度/总蛋白浓度×100

1.2.7 超滤分离

苦荞蛋白水解物通过UF超滤膜（截留分子量为3 kDa）进行超滤，超滤条件为：25℃、离心转速4 500 r/min、30 min，收集滤过液（＜3 kDa）和未滤过液（＜3 kDa），并分别测定两种级分的DPPH自由基清除率，选取抗氧化活性强的级分冷冻干燥，于-20℃保存，继续进行下一步凝胶色谱分离纯化。

1.2.8 凝胶过滤色谱分离

将样品配成一定浓度，取5 mL上样于经超纯水平衡后的葡聚糖凝胶（G-15）过滤柱，用超纯水进行洗脱，流速为0.8 mL/min，自动收集器每6 min收集1管，分别检测每管洗脱液的吸光度值（214 nm），并绘制洗脱曲线。收集各峰对应组分，测定其DPPH自由基清除率。

1.2.9 抗氧化能力测定

1.2.9.1 还原能力

取1mL待测溶液与0.2mL磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH 6.6）及1.5 mL 0.3%铁氰化钾溶液混合，50℃反应20 min。依次加入1 mL三氟乙酸（10%）、0.5 mL三氯化铁（0.3%）和3 mL蒸馏水，摇匀，测定700 nm处吸光值。

1.2.9.2 DPPH自由基清除率

参考Zheng等[14]的方法并稍作修改。取2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液与2 mL样品待测液，混合避光反应30 min后在517 nm处测吸光度值。空白组用乙醇代替DPPH溶液；对照组为无水乙醇代替样品与DPPH乙醇溶液混合。计算公式如下：

式中：A1为试验组吸光度；A2为空白组吸光度；A3为对照组吸光度。

1.2.9.3 ABTS＋自由基清除率

取0.2mL待测溶液于试管中，加入3.8mL的ABTS＋工作液（配置方法参考文献[14]），室温（25℃）避光反应6 min后，于734 nm处测定吸光值。计算公式如下：

式中：A1为样品与ABTS＋反应后的吸光值；A2为样品自身的吸光值；A3为未加样品的ABTS＋吸光值。

1.2.10 数据处理与分析

所有试验均重复3次，采用SPSS 19.0进行数据统计分析，并用Duncan多重比较检验各处理平均数之间的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

不同酶水解产物的抗氧化活性见图1。

图1 不同酶水解产物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of the corresponding products of each enzyme hydrolysis

由图1可知，在3种酶的水解作用下，胃蛋白酶的水解产物清除DPPH自由基的能力最强，当胃蛋白酶浓度为1.5 mg/mL时，其自由基清除率最高达到71.25%，且随着胃蛋白酶浓度的增加，水解产物的DPPH自由基清除率呈逐渐升高的趋势。碱性蛋白酶水解产物的清除能力最低。胃蛋白酶水解产物清除DPPH自由基的能力优于胰蛋白酶和碱性蛋白酶，可能是因为每种酶的切割位点有较大差异，产生的多肽序列不同[15]，从而导致水解产物的最终抗氧化能力不同。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 时间对苦荞蛋白水解度的影响

时间对苦荞蛋白水解度的影响见图2。

图2 时间对苦荞蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of time on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由图2可知，随着水解时间的延长，苦荞蛋白的水解度呈现先升高后逐渐平缓的趋势，在水解时间为2 h时其水解度较高，为26.21%。这可能是因为蛋白酶保持活力的时间是一定的，超过一定时间后，酶的活性会逐渐下降。此外，水解时间在2 h之前，蛋白没有充分被水解；而2 h之后，苦荞蛋白在酶的作用下基本被完全水解，且随着底物消耗殆尽，反应进程增加缓慢，从而使水解度呈现平缓的趋势。

2.2.2 温度对苦荞蛋白水解度的影响

温度对苦荞蛋白水解度的影响见图3。

图3 温度对苦荞蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由图3可见，温度对苦荞蛋白水解反应的影响比较显著，温度过高或者过低对水解度均有负面影响。随着温度的升高，苦荞蛋白水解度呈现先增高后降低的趋势，当温度为37℃时，水解度达到最大值（27.67%）。这可能是因为37℃为胃蛋白酶的最适温度，此时可以最大程度的发挥胃蛋白酶的催化酶切效果；而过高或过低的温度都会对酶的活力产生不利影响，不能使酶与底物充分结合，从而导致水解度较低[16]。

2.2.3 pH值对荞麦蛋白水解度的影响

pH值对荞麦蛋白水解度的影响见图4。

图4 pH值对荞麦蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由图4可见，酶解pH在1.0～1.5之间时，苦荞蛋白水解度随着pH值的增加而增大，pH值为1.5时，蛋白水解度最大，为27.19%，说明该酸性条件最利于酶与底物相结合。当pH值大于1.5时，水解度明显降低，可能是因为该pH值条件影响酶活性中心上必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态[17]，因此影响了酶与底物的结合，从而使苦荞蛋白水解度降低。

2.3 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果，选取温度、pH值、时间3个因素，以水解度作为响应值，进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计，结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

续表3 响应面试验设计及结果Continue table 3 Design and results of response surface experiment

利用Design Expert 7.0软件对表3结果进行回归分析，所得的方差分析结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surface regression model

回归模型的预测相关系数R2为0.979 5，校正相关系数 R2Adj为 0.953 1，该模型的 P＜0.000 1，表明该响应回归模型达到了极显著水平；失拟项P（0.078 1）＞0.05，不显著。以上数据表明，得到的模型和试验数据拟合度较好。根据回归系数，得出苦荞蛋白水解度的二次多元回归方程为：Y=30.31＋3.21X1＋1.74X2＋1.88X3＋2.36X1X2＋2.08X1X3＋1.52X2X3-2.35X12-6.88X22-3.60X32。

回归系数的显著性分析结果表明，酶解温度、pH值、时间对水解度的影响极显著，时间与温度交互项（X1X2）、时间二次项（X12）、温度二次项（X22）、pH 值二次项（X32）对应响应值为极显著；时间与pH值交互项（X1X3）、温度与 pH 值交互项（X2X3）对应响应值为显著。该回归方程较好地描述了各变量因素与响应值水解度之间的真实关系，可通过该方程确定苦荞蛋白酶解的最佳工艺条件。

在响应曲面上可根据图的坡度反映各因素对水解度的影响[18]。根据回归方程做出三维曲面及等高线图，如图5～图7所示。

图5 酶解时间与温度的交互作用Fig.5 Interaction between enzymatic hydrolysis time and temperature

图6 酶解时间与pH值的交互作用Fig.6 Interaction between enzymatic hydrolysis time and pH

图7 酶解温度与pH值的交互作用Fig.7 Interaction between enzymatic hydrolysis temperature and pH

图5显示当时间不变时，随温度的增加，水解度先增加后降低，变化幅度显著（P＜0.01），且时间和温度的等高线呈椭圆形，说明时间和温度对水解度的交互作用显著[19]。图6显示随时间和pH值增加，水解度先增加后降低；pH值和温度的等高线接近圆形，说明pH值和温度的交互作用不显著。图7显示水解度随温度与pH值的增加先升高后降低，温度与pH值的等高线呈椭圆形，说明温度与pH值的交互作用显著，且等高线沿着pH值轴方向比温度方向密集，说明pH值对水解度的影响比温度显著。

2.4 最佳工艺的验证

利用Design Expert 7.0软件得到苦荞蛋白最佳酶解工艺：时间2.45 h，温度38.61℃，pH 1.73。为方便实际操作，将最佳工艺条件设为：时间2.5 h、温度38℃、pH 2.0。此条件下苦荞蛋白的水解度达到（32.68±0.21）%，与理论预测值32.77%基本吻合，说明采用响应面法优化苦荞蛋白酶解工艺是可行的。

2.5 超滤

超滤分离组分及其抗氧化活性见表5。

本试验采用超滤离心管对制备的苦荞蛋白水解物进行膜超滤分离，得到了2种分子量组成的抗氧化肽：I（＜3 kDa）和II（＞3 kDa）。其中级份I占58.3%，级份II占41.7%，由此可见，苦荞蛋白水解物多肽主要以小分子量肽段（＜3 kDa）组成。试验进一步采用DPPH法考察级份I和级份II的抗氧化能力，由表5可知，级份I（＜3 kDa）具有更低的IC50值，即低分子量组分的抗氧化活性较强，高分子量组分的抗氧化活性较弱。可能是因为小分子量多肽由于其肽链较短，导致空间位阻较小，因此内部的活性基团更容易暴露，便于其与自由基反应[20]。这与李华等[21]和王章存等[22]的研究结果类似。

2.6 凝胶过滤色谱

进一步将抗氧化活性较强的级份I进行凝胶过滤色谱分离，分离曲线见图8。

图8 凝胶过滤分离曲线Fig.8 Gel filtration separation curve

如图8所示，级份I经凝胶色谱分离后得到3个峰。峰1最先被洗脱出来，保留时间较短，说明峰1的分子量较大，不能进入凝胶颗粒内部而最先流出凝胶柱[23]。峰2和峰3的保留时间较长，说明峰2和峰3组分分子量较小，在流经凝胶柱时进入颗粒内部从而延长洗脱时间。

2.7 凝胶分离各峰的抗氧化活性比较

凝胶分离各组分的抗氧化活性见表6。

表6 凝胶分离各组分的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of each component separated by gel chromatography

由表6可知，3种抗氧化评价体系均显示峰3组分的抗氧化活性最强，其次是峰2，峰1的抗氧化能力最弱。结合图8可以发现，峰3组分的强抗氧化活性可能与其分子量有关，小分子量酶解肽具有较好的抗氧化效果。

3 结论

本试验以DPPH自由基清除率为指标，分别用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶对提取的苦荞蛋白进行酶解，得到胃蛋白酶为制备苦荞蛋白抗氧化肽的最适酶。通过单因素和响应面试验优化苦荞蛋白水解工艺，得到最佳工艺条件：时间2.5 h、温度38℃、pH 2.0，在此条件下苦荞蛋白水解度为32.68%。采用超滤法和凝胶过滤色谱法对苦荞蛋白水解物分离纯化，结果表明，分子量＜3 kDa的水解物具有显著的抗氧化活性，经凝胶色谱进一步分离得到3个峰组分，小分子量峰组分显示出最强的抗氧化活性。本研究为后续试验深入研究苦荞蛋白抗氧化活性肽奠定良好基础。