肖遥 吴双 黄为钧 孙瑞茜 蒋里 张耀夫 赵进喜 傅强

2型糖尿病是临床常见的慢性内分泌代谢性疾病，其发生、发展和遗传、饮食、环境等多种因素有关。近年来，有研究显示，肠道菌群和2型糖尿病的发生、发展存在一定联系，2型糖尿病的发病可能与肠道菌群失调有关[1-4]。将微生物作为生物标志物以分析慢性病的进展、靶向性调控菌群以改善疾病等，已经成为了基础及转化研究关注的热点。传统的细菌研究方法依赖于微生物培养和分离鉴定，但是绝大多数菌群无法在日常环境下通过传统手段获得。16s rDNA测序技术不需要对样本中菌群进行培养，而是直接对样本进行核酸提取，测定其所有微生物的核酸序列，这使得探索菌群构成差异、筛查病原体标志物成为可能。本研究基于16s rDNA测序的技术手段，对阳明、太阴不同体质2型糖尿病患者肠道菌群进行分析，探究2型糖尿病肠道菌群与中医阳明、太阴体质的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

研究对象为2017年1月至2018年6月期间，北京中医药大学东直门医院肾病内分泌科收治的新发2型糖尿病患者30例，其中男18例，女12例，年龄27～65岁，平均(46.47±11.92)岁。健康对照组13例，其中男8例，女5例，年龄25～65岁，平均(45.54±12.19)岁。研究经由北京中医药大学东直门医院伦理委员会批准。

1.2 纳入标准

(1)经由内分泌专科医师根据中华医学会糖尿病学分会制定的《中国2型糖尿病防治指南》[5](2013年版)评估后确诊的2型糖尿病患者；(2)病程≤3个月的新发2型糖尿病患者；(3)经由《三阴三阳体质辨识量表》[6]进行体质测评，测评结果经计算机自动判读，符合阳明胃热体质(简称阳明体质)和太阴脾虚体质(简称太阴体质)的患者；(4)自愿参加本项目并签署知情同意书。

1.3 排除标准

(1)存在严重肝肾疾病、心脑血管疾病、肿瘤、炎症性肠病等疾病的患者；(2)受试者采样前1个月内服用抗生素、糖皮质激素等药物，采样前2周内服用微生物制剂等可能对肠道菌群有较大影响的药物。

1.4 分组

对符合2型糖尿病诊断和纳入标准的2型糖尿病患者和健康者，并经由《三阴三阳体质辨识量表》测评和计算机自动判读为阳明体质和太阴体质。健康对照组选择性别及年龄与疾病组相匹配，且符合阳明胃热体质和太阴脾虚体质的受试者。入组阳明体质2型糖尿病组14例，太阴体质2型糖尿病组16例；阳明体质健康组6例，太阴体质健康组7例。

1.5 粪便标本采集

用粪便收集器采集糖尿病观察组与健康对照组患者新鲜粪便样本2～3 g，迅速放入-80℃保存。

1.6 各组样本菌群DNA提取与测序

1.6.1 提取 使用QIA amp Power Fecal DNA试剂盒(QIAGEN，德国)从0.5 g粪便样品中提取DNA。选取细菌16s rDNA的V3～V4区序列进行基因扩增及基因测序。所用引物序列为：541F，5’-CTACGGGNBGCASCAG-3’；805R，5’-CTACNVGGGTATCTAATCC-3’。PCR反应体系包括：5 μL 5×GC缓冲液，0.5 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μL KAPA HiFi Hot Start DNA聚合酶，0.5 μL引物(10 pM)和50～100 ng模板DNA混合成25 μL体系。使用AMPure XP磁珠纯化PCR产物，去除游离引物和引物二聚体等。使用引物扩增PCR纯化的产物。然后配置25 μL PCR反应体系包括，5 μL 5×GC缓冲液，0.75 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μL KAPA HiFi Hot Start DNA聚合酶，1.5 μL引物(10 pM)和5 μL纯化产物。PCR反应条件包括95℃ 3分钟，然后8个循环，95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，最后72℃延伸5分钟。随后通过AMPure XP磁珠纯化扩增产物形成文库。

1.6.2 测序 使用Illumina Hiseq测序平台完成16s rDNA V3～4区测序。

1.7 阳明、太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群生物信息学数据处理与分析

采用快速短读取长度装配工具(Fast Length Adjustment of SHort reads，FLASH，是一个快速且精确的双端测序reads融合工具)软件将测序得到的双端序列拼接成一条目标区域序列[7]。对目标序列进行质控过滤，过滤后的序列与参考数据库(USEARCH 64 bit v8.0.1517)作比对，去除嵌合体序列得到最终优化序列。通过随机减法，根据样本的最小值对每个样本的读取次数进行归一化。根据97%的序列相似性水平，利用微生物组定量分析(Quantitative Insights to microecology,QIIME[8])软件包中的Uclust算法进行可操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)聚类分析。基于Silva参考数据库对每个样品的OTUs进行物种分类学注释。

1.7.1 肠道菌群Alpha多样性分析 根据QIIME并基于加权和非加权Unifrac距离矩阵计算样本的Alpha多样性[8]。Alpha多样性可以体现组内微生物群落的丰富度和多样性。计算菌群丰富度的指数为查奥指数(Chao)、艾斯指数(Ace)、多样性香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)。分析阳明、太阴体质2型糖尿病患者不同组别所含的肠道菌群、种属总数量。

1.7.2 肠道菌群OTUs聚类分析 对测序有效数据，进行OTUs聚类和丰度统计。分析阳明、太阴体质2型糖尿病患者和健康者肠道菌群组分数量。

1.7.3 肠道菌群群落结构组成分析 在OTU分类学基础上，分析阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者肠道菌群的群落组成及分布。

1.7.4 肠道菌群物种差异分析 检测糖尿病组、对照组中不同体质患者组间丰度差异显著的物种，基于显著差异物种进行组间分析，使用线性判别分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)、效应大小(LEfSe)方法来识别群体间丰度差异具有统计学意义的物种[9]，作为组间显著差异的生物标志物，筛选出对阳明、太阴体质2型糖尿病划分产生显著性差异影响的群落。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 阳明、太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群Alpha多样性分析

对阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者肠道菌群不同菌落Alpha多样性分析结果，见表1。阳明体质2型糖尿病组、太阴体质2型糖尿病组与阳明体质健康组、太阴体质健康组各组间菌群丰度Chao指数、Ace指数，多样性Shannon指数、Simpson指数，无显著统计学差异(P>0.05)。提示阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者所含的肠道菌群总数量、种属总数量基本一致。

2.2 阳明、太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群OTUs聚类分析结果

对阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者肠道菌群测序有效数据进行OTUs聚类和丰度统计，43个粪便样本测序一共得到12388个OTUs，平均每个样本包含288个OTUs，各样本中含有的OTUs数量，见图1。所有序列依据97%相似度水平划分为607个OTUs，绘制可直观表现三组OTU数目组成相似性及重叠情况的Venn图，见图2。结果显示，太阴体质健康组组OTUs数目为539；太阴体质糖尿病组OTUs数目为579；阳明体质健康组组OTUs数目为527；阳明体质糖尿病组组OTUs数目为579。其中484个OTUs为四组共有，达到79.74%，说明四组间的OTUs相似性较高。提示阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者各组具有共同种属肠道菌群种属。

在阳明、太阴体质2型糖尿病患者以健康者四组中，各组均检出其特异的OTUs，其中阳明体质糖尿病组为4个，太阴体质糖尿病组为11个，阳明体质健康组为2个，太阴体质健康组为2个，结果见图2。提示阳明体质2型糖尿病患者与太阴体质2型糖尿病患者二者肠道菌群具有特异性。

2.3 阳明、太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群群落结构组成分析结果

对阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者肠道菌群的群落组成分析，结果见图3。菌群结构由4个主要的菌门组成(将检测到的丰度低于1%的菌群合并为其他)：厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门，在部分样本中也检测到了梭杆菌门。在阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者肠道菌群中均存在上述4个菌门。

表1 阳明、太阴体质2型糖尿病患者与健康组Alpha多样性分析结果

注：阳明、太阴体质2型糖尿病及健康组肠道菌群样本编号(TD：太阴体质健康组；TS：太阴体质糖尿病组；YD：阳明体质健康组；YS：阳明体质糖尿病组)

图1 阳明、太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群OTUs聚类分析结果

注：YS：阳明体质糖尿病组；TS：太阴体质糖尿病；YD：阳明体质健康组；TD：太阴体质健康组)

图2 阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者OTUs韦恩示意图

2.4 阳明、太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群物种差异分析结果

对全体样本进行LEfSe分析，评估差异显著的物种的影响力大小(即LDA score)，找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种，结果见图4。太阴体质糖尿病组有显著特异性的群落，肠道菌群拟杆菌纲、拟杆菌目、拟杆菌门、拟杆菌科、拟杆菌属、紫单胞菌科、萨特氏菌属、副杆状菌属、理研菌科、另枝菌属10个菌群组分升高。而阳明体质2型糖尿病组、阳明体质健康组、太阴体质健康组在组别对比中，LDA分值图无显示，表明无显著特异性的群落。

在2型糖尿病患者中，太阴体质2型糖尿病组检测到11种显著升高的肠道菌群组分，分别是伯克氏菌目、产碱杆菌科、β-变形菌纲、理研菌科、另枝菌属、瘤胃菌科、紫单胞菌科副杆菌属、拟杆菌纲、拟杆菌目、拟杆菌门，以拟杆菌门等为主；阳明体质糖尿病组检测到2种显著升高的肠道菌群组分，分别是厚壁菌门及模糊分类群，以厚壁菌门等为主。表明二者肠道菌群组分存在差异，结果见图5。

3 讨论

3.1 糖尿病患者肠道菌群与阳明、太阴体质具有相关性

早在《黄帝内经》时期，古代医家已经认识到消渴病与肠道的密切联系，如《素问·阴阳别论篇》载有“二阳结谓之消”的论述。近年来，随着肠道菌群的结构与功能成为生物学和医学的研究热点，中国人群中糖尿病患者与非糖尿病患者在肠道微生物组成上的差异得到证实，2型糖尿病与肠道菌群具有相关性[10]。

注：阳明、太阴体质2型糖尿病及健康组肠道菌群样本编号(TD：太阴体质健康组；TS：太阴体质糖尿病组；YD：阳明体质健康组；YS：阳明体质糖尿病组)

图3 阳明、太阴体质2型糖尿病患者及健康者肠道菌群在门分类水平的组成结构图

图4 LEfSe分析组间具有统计学差异的生物标记物

图5 LEfSe分析阳明、太阴2型糖尿病组组间具有统计学差异的生物标记物

有学者研究了健康人群中，体形胖瘦与消化道菌群的关系，体型消瘦者消化道中的菌群主要以拟杆菌为主，而肥胖者消化道中厚壁菌更多[11-13]。但中国人的体质分类，不是简单的分为体形消瘦与肥胖，以体质胖瘦不能反映中国人体质与肠道菌群的深层关系。也有学者研究了糖尿病与健康人群的肠道菌群特点，2型糖尿病患者相较于健康人群的肠道菌群存在厚壁菌门、拟杆菌门丰度的变化特点[14-15]。但临床上糖尿病的证候变化多样，仅以后壁菌门和拟杆菌门丰度变化也不能反映其证候特点。

赵进喜教授[16]认为，中医证候与肠道菌群的相关性研究，不能脱离体质。应该基于临床，基于不同体质的人进行证候与肠道菌群的相关性研究。体质是糖尿病及其并发症发生、发展的基础[17]。临床上不同体质的人，患糖尿病后，会表现出不同系统的病变证候，进一步的发生并发症也各有特点。如阳明体质者常表现为胃肠结热证，太阴体质者常表现为脾胃虚弱证。注重辨三阴三阳体质[16-17]，并通过其指导临床治疗糖尿病及其并发症，常常能取得满意的疗效。既然体质是糖尿病不同证候的内在发生基础，对于2型糖尿病患者肠道菌群变化对不同体质所表现出来的证候及其与三阴三阳体质中的阳明、太阴体质是否有关等问题的研究尚未见报道。因此，课题组采用16s rDNA测序的技术手段，进行了2型糖尿病患者肠道菌群与阳明、太阴体质的初步相关研究，以揭示肠道菌群变化与阳明、太阴体质之间的内在联系。

本研究结果显示，阳明、太阴体质2型糖尿病患者与健康者所含的肠道菌群总数量、种属总数量是一致的，肠道菌群结构也基本一致。它们既有共同的菌群种属，又有各自独有的菌群种属，表现为菌群失调。肠道菌群组分的变化，在太阴体质2型糖尿病组与阳明体质2型糖尿病组之间存在着显著差异，太阴体质2型糖尿病组有11种显著升高的肠道菌群组分，主要差异物种以拟杆菌门等为主；阳明体质2型糖尿病组有2种显著升高的肠道菌群组分，主要差异物种以厚壁菌门等为主。2型糖尿病患者肠道菌群因不同的体质类型而表现出不同的菌群特征，说明2型糖尿病患者肠道菌群变化与阳明、太阴不同体质有一定关系。

3.2 糖尿病患者肠道菌群变化可能是形成阳明、太阴体质差异的内在因素

阳明胃热体质和太阴脾虚体质都是容易发生糖尿病的体质类型。一般来讲，阳明体质之人，平素体壮，能吃、能睡、能干，有便干倾向，患病可发生糖尿病胃肠病变便秘。太阴体质之人，体质相对虚弱，平素食欲较差，有腹泻倾向，面色黄，消瘦或虚胖，患病可发展为糖尿病胃肠植物神经病变等。糖尿病发病后表现为阳明胃热体质和太阴脾虚体质不同的证候特点，可能与糖尿病肠道菌群变化不同有关。本研究证实，2型糖尿病患者太阴体质组以拟杆菌门等为主，阳明体质组以厚壁菌门等为主。

肠道菌群作为环境因素调节脂肪存储[18]，在肥胖者肠道菌群中厚壁菌增多而拟杆菌减少，拟杆菌与厚壁菌比值下降。厚壁菌门为革兰阳性菌，拟杆菌门为革兰阴性，两者占肠道细菌总数的98%以上。拟杆菌主要产生乙酸盐和丙酸盐，厚壁菌产生丁酸盐。乙酸是胆固醇合成的底物，丙酸影响脂肪生成和糖异生。丁酸是结肠细胞的主要能量来源。后壁菌门可以促进机体对能量的利用，阳明体质偏于肥胖，可能与阳明体质2型糖尿病肠道菌群以厚壁菌门为主有关。拟杆菌门参与多糖代谢、胆汁酸和类固醇代谢等诸多功能，也可以发酵碳水化合物。肠道革兰阴性杆菌过度生长繁殖，导致肠道原有的黏膜屏障受到破坏，使肠道通透性增高，大量的细菌内毒素(LPS)通过损害的肠黏膜屏障进入组织，通过免疫细胞表面的信号传导通路(LPS/CD14/TLP4)激活炎症的级联反应，导致机体产生慢性炎症反应[19]；细菌内毒素又是调节胰岛素抵抗(IR)的关键因素，可引起IR。肠道慢性炎症，大便容易腹泻，使人体消瘦，符合太阴体质脾虚的表现，因此，太阴体质偏于消瘦，可能与太阴体质2型糖尿病以拟杆菌门等为主有关。另外，太阴体质2型糖尿病患者肠道菌群中还存在伯克氏菌目和产碱杆菌等。伯克氏菌目是β-变形菌纲的一个目。变形菌门在正常肠道内含量较低，常低于8%，多数为致病菌。产碱杆菌为产碱杆菌科中重要的一种，一般寄生于动物肠道中，也是一种条件致病菌[20]。这些致病菌的存在，引起或加重了肠道慢性炎症，支持糖尿病太阴体质患者腹泻、消瘦、身体较弱、纳食较差等临床表现。

总之，2型糖尿病患者肠道菌群失调与阳明、太阴体质有关，其肠道菌群的变化可能是形成阳明、太阴体质差异的内在因素。通过对不同体质2型糖尿病患者肠道菌群差异进行分析，有助于深化三阴三阳体质学说的科学内涵，从而为指导临床辨证论治提供参考。