邢雅娟， 谢作甫， 单胜道， 成 忠， 沈海涛， 王志明

(1.浙江科技学院 环境与资源学院， 浙江省废弃生物质循环利用与生态处理重点实验室， 浙江 杭州 310023； 2.浙江景兴纸业股份有限公司， 浙江 平湖 314214)

近年来由于造纸原料的缺乏，以废纸为原料的再生纸行业迅速发展。与直接利用植物纤维制浆工艺相比，废纸再生造纸废水的污染负荷相对较轻，但仍远远超过排放标准[1-2]。在制浆过程中，一般每生产1 t废纸浆，废水排放量达100～150 m3[3]；大量的废弃物除含有塑料粒、塑片、泥、沙粒外，还有细微的纤维素和半纤维素、木质素、油、胶粒、矿粒、填料等混在废水中排入江河，其废水中的SS和CODCr等污染指标大大高出国家《制浆造纸工业水污染排放标准》(GB3544-2008)，若不加处理直接排放，将对环境带来污染和伤害[4]。随着废纸再生利用比重的不断提高，废纸造纸废水这一新污染源已引起人们的重视[5-7]。

内循环厌氧反应器(Internalcirculationreactor,IC)是荷兰PAQUES公司于1985年在UASB反应器的基础上研发的第三代高效厌氧反应器[8]。它具有占地面积小、高径比大、有机负荷高、稳定性好等诸多优点，适用于处理多种有机废水。自1996年以来，高效厌氧内循环反应器迅速应用于制浆造纸废水的处理。IC厌氧反应器当前在造纸行业应用较多的是用各类废纸作原料的造纸厂，即二次纤维制浆造纸工厂，其中包括脱墨和不脱墨的各类废纸制浆工艺的废水处理。荷兰PAPQES环保技术公司在1996年以来的工程项目中，IC反应器工程的比例超过了UASB反应器，制浆造纸工业已成为IC反应器应用较多的领域之一[9]。

以膨胀颗粒污泥床(EGSB)和内循环(IC)反应器为代表的高效厌氧装置，垂直高度较大(一般超过15 m甚至25 m)，在运行中，随反应液循环的功能菌群承受着巨大的静水压差胁迫[10]。厌氧消化菌是高效厌氧反应器的功能之源，因此，本文应用16SrRNA基因-IlluminaMiSeq高通量测序技术，分析研究处理造纸废水UMIC反应器中不同高度的微生物群落结构及多样性，以期探明IC反应器中厌氧消化菌的种类组成、空间分布特性，为该反应器工业化应用中高效、稳定运行提供指导。

1 材料与方法

1.1 样品采集

取自嘉兴某造纸企业处理造纸废水的厌氧反应器中的厌氧颗粒污泥，取样口1 m，2.5m，5 m，7.5 m，10 m，12.5 m，15 m(见图1)所取样品分别记为样品1，2，3，4，5，6，7号(见图2)。样品于-20°C冰箱中保存至DNA提取。

图1 UMIC反应器取样口

图2 颗粒污泥样品

1.2 微生物基因组DNA的提取及测序

采用DNA试剂(3SIDNAisolationkitv2.2forenvironmentalsamples，上海申能博彩生物科技有限公司)抽提样品基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检验基因组DNA，所得片断约为23kb。将基因组DNA保存于-20°C。随后选用细菌通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)；古菌通用引物344F(5’-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3’)和915R(5’-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3’)进行PCR扩增[11-12]。PCR扩增程序为：95°C 3 min，(95°C 30 s，55°C 30 s，72°C 45 s)27个循环，72°C 10 min。PCR产物经纯化与定量后上机(IlluminaMiseqPE250/PE300平台，上海美吉生物工程股份有限公司)。

2 结果与讨论

2.1 微生物群落多样性分析

7组颗粒污泥细菌群落的生物多样性如表1所示；7组颗粒污泥古菌群落的生物多样性如表2所示。7组样品中细菌Shannon指数大小为4>7>6>3>5>1>2，7组样品中古菌Shannon指数大小为4>7>6>2>1>5>3。表明在UMIC反应器中，细菌的多样性要高于古菌，且在反应器7.5 m处细菌和古菌的多样性都是最高。

表1 细菌群落的生物多样性

表2 古菌群落的生物多样性

2.2 门水平的优势菌群分布特征

在门水平上的细菌群落组成如图3所示。7组颗粒污泥样品中细菌群落结构在门分类水平上具多样性水平较高，均达到13个门以上。主要包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋菌门(Spirochaetae)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、互养菌门(Synergistetes)等。7种类群的相对丰度比例约占70%～80%。就平均而言，在7个样品中，拟杆菌门和绿弯菌门在颗粒污泥中占有最大的丰度比例，两者相加相对丰度比例均占50%以上。其中，Bactericides是厌氧过程中酸化水解复杂有机大分子的菌门[13]。

各组颗粒污泥样品在门分类水平上的细菌群落丰度存在一定的差异。从图3累积柱状图中的微生物相对丰度数据标签可知：拟杆菌门在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为7>6>1>4>2>5>3，绿弯菌门在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为2>3>5>1>4>6>7，厚壁菌门在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低则较为平均。说明在反应器的顶部拟杆菌门微生物分布较多，而绿弯菌门微生物分布较少。厚壁菌门在反应器中分布较为均匀。

图3 细菌菌门水平微生物多样性

在门水平上的古菌群落组成如图4所示。7组颗粒污泥样品中古菌群落结构在门分类水平上具多样性水平较低，主要包括广古生菌门(Euryarchaeota)、深古菌门(Bathyarchaeota)，除4号样品外，两者相加相对丰度达90%以上。在3号和5号样品中，主要分布着广古菌门古菌，相对丰度达90%以上。各组颗粒污泥样品在门分类水平上的古菌群落丰度存在一定的差异。从图4累积柱状图中的微生物相对丰度数据标签可知：广古生菌门(Euryarchaeota)在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为5>3>2>6>7>4>1，深古菌门(Bathyarchaeota)在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为1>7>6>2>4>5>3。说明在UMIC反应器的1m处，Euryarchaeota丰度相对较低，而Bathyarchaeota丰度相对较高。在5m和10m处，Euryarchaeota占绝对优势。

图4 古菌菌门水平微生物多样性

2.3 属水平的优势菌群分布特征

在属水平上的细菌群落组成如图5所示。7组颗粒污泥样品中细菌群落结构在属分类水平上具多样性水平较高，涵盖了29个属以上。主要包括Anaerolinea，Bacteroidetes_vadinHA17，Paludibacter，norank_f_Anaerolineaceae，Proteiniphilum，norank_f_FD35，norank_p_WWE3，Ruminococcus，Treponema，norank_p_WS6，Syntrophobacter，Georgenia等。12种类群的相对丰度比例约占60%～75%。就平均而言，在7个样品中，Anaerolinea在颗粒污泥中占有最大的丰度比例。各组颗粒污泥样品在属分类水平上的细菌群落丰度存在一定的差异。从图5累积柱状图中的微生物相对丰度数据标签可知：Anaerolinea在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为2>3>5>1>6>7>4，与绿弯菌门在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低(2>3>5>1>4>6>7)较为一致。Anaerolinea它属于严格的厌氧菌科，常见于各种厌氧反应器中，能适应高浓度的苯酚废水，参与苯酚的降解[14]。Ruminococcus的丰度虽不是很高，却能降解淀粉和纤维素和其它多糖以及蛋白质和中短链有机酸，是完成厌氧发酵水解阶段的重要微生物[15]。

图5 细菌菌属水平微生物多样性

在属水平上的古菌群落组成如图6所示。7组颗粒污泥样品中古菌群落结构在属分类水平上涵盖了10个属以上。主要包括Methanosaeta，norank_p_Bathyarchaeota，Methanobacterium，Methanosarcina等。除4号样品外，其余6组样品中4种类群的微生物相对丰度比例约占90%以上。其中，Methanosaeta在颗粒污泥中占有最大的丰度比例，7组样品中相对丰度比例均达40%以上。各组颗粒污泥样品在属分类水平上的古菌群落丰度存在一定的差异。从图6累积柱状图中的微生物相对丰度数据标签可知：Methanosaeta在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为3>2>5>1>7>6>4；norank_p_Bathyarchaeota在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为1>7>6>2>4>3>5；Methanobacterium在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为5>3>4>2>7>1>6；Methanosarcina在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为5>3>6>4>2>7>1。Methanobacterium能以H2作为电子供体，以CO2作为电子受体产甲烷[16]；Methanosaeta属于典型的乙酸分解型产甲烷菌，是严格的厌氧菌[17]。

图6 古菌菌属水平微生物多样性

3 结论

(1)采用16S rRNA基因Illumina MiSeq高通量测序技术对7组UMIC反应器颗粒污泥样品进行测序。7组样品中细菌Shannon指数大小为4>7>6>3>5>1>2，7组样品中古菌Shannon指数大小为4>7>6>2>1>5>3。说明在UMIC反应器中，细菌的多样性要高于古菌，且在反应器7.5 m处微生物多样性最高。

(2)7组颗粒污泥样品中微生物群落结构在门分类水平上细菌多样性水平较高，而古菌多样性水平较低。细菌主要包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋菌门(Spirochaetae)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、互养菌门(Synergistetes)等；古菌主要包括广古生菌门(Euryarchaeota)、深古菌门(Bathyarchaeota)等。在反应器的顶部拟杆菌门微生物分布较多，而绿弯菌门微生物分布较少。厚壁菌门在反应器中分布较为均匀；在UMIC反应器的1m处，Euryarchaeota丰度相对较低，而Bathyarchaeota丰度相对较高。在5 m和10 m处，Euryarchaeota占绝对优势。

(3) 7组颗粒污泥样品中微生物群落结构在属分类水平上细菌多样性水平较高，而古菌多样性水平较低。细菌主要包括Anaerolinea，Bacteroidetes_vadinHA17，Paludibacter，norank_f_Anaerolineaceae，Proteiniphilum、norank_f_FD35，norank_p_WWE3，Ruminococcus，Treponema、norank_p_WS6，Syntrophobacter，Georgenia等；古菌主要包括Methanosaeta，norank_p_Bathyarchaeota，Methanobacterium，Methanosarcina等。Anaerolinea在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为2>3>5>1>6>7>4，与绿弯菌门在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低(2>3>5>1>4>6>7)较为一致。Methanosaeta在颗粒污泥中占有最大的丰度比例，其在各组颗粒污泥样品中相对丰度高低为3>2>5>1>7>6>4。