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青钱柳对2型糖尿病大鼠早期肾损伤标志物以及氧化应激的影响

2020-05-15王蕾蕾高学敏贾岚华姞安孟靓姚骏凯付璐王景霞

环球中医药 2020年3期
关键词:青钱柳空腹批号

王蕾蕾 高学敏 贾岚 华姞安 孟靓 姚骏凯 付璐 王景霞

糖尿病并发肾脏功能损害是糖尿病患者致死、致残的重要原因,预防糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的发生发展极为重要[1-2]。控制血糖和抗高血压是临床上有效的治疗策略,但疗效并不理想[3],如在DN患者中使用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能显著延缓DN进程[4],但存在不良反应和用药局限性,因此需探索更加安全、有效的药物[5]。而氧化应激是DN发展中最关键的因素,持续性高血糖导致的糖代谢紊乱使机体产生大量活性氧物质[6],损伤肾脏系膜细胞,导致肾脏纤维化。中药在DN患者临床症状改善率,降低肌酐值、尿蛋白,改善肾功能等方面均具有较大的优势,日益受到重视[7-8]。

青钱柳是双子叶植物纲胡桃科青钱柳属植物,是中国特有珍稀树种资源,与制作阿司匹林的柳树、防治癌症和肿瘤的紫杉醇并称“医学界三棵树”[9]。民间常用其叶片做茶,其性味甘寒,有生津止渴的功效,具有良好的降糖效果[10]。课题组前期研究表明青钱柳能够有效缓解肝脏氧化应激状态[11-12]。为探究青钱柳是否能降低血糖,缓解氧化应激,对糖尿病早期肾损伤起到保护作用,本研究应用高脂饲养结合腹腔注射链尿佐菌素复制2型糖尿病大鼠早期肾损伤模型,通过观察青钱柳叶对2型糖尿病大鼠肾功主要指标和早期肾损伤标志物的影响,探讨其对糖尿病早期肾损伤的保护作用,并从抗氧化应激的角度初步探讨青钱柳抗2型糖尿病大鼠早期肾损伤的作用机制,为青钱柳防治DN的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠,雄性,SPF级,8周龄,体重180~200 g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,实验动物许可证号:SCXK(京)2016-0002,饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室。普通饲料和高脂饲料(猪油10%、蔗糖15%、蛋黄粉15%、酪蛋白5%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持饲料52.6%),由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 实验药物和试剂

实验药物:青钱柳叶水提物(无限极中国有限公司提供本科研用)。制备方法:5 kg原料,第一次加12倍水,煮沸保持微沸2 小时,过滤,滤渣再加10倍水,煮沸保持微沸1 小时,过滤合并2次滤液,浓缩干燥成干膏,粉碎过80目筛,干燥保存待用。

链尿佐菌素(美国SIGMA公司,批号:#WXBC2544V),盐酸二甲双胍(中美上海制药有限公司,0.5 g/片)。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(索莱宝公司,批号:c1013)。肌酐(creatinine,CRE,批号:20190320)、尿素氮(urea nitrogen,UREA,批号:20190320)、脂质运载蛋白(neutral gelatinase lipoprotein,NGAL,批号:20190320)、肾损伤因子1(kidney damage factor 1,KIM-1,批号:20190320)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP,批号:20190320)、丙二醛(malondialdehyde,MDA,批号:20190320)、活性氧(reactive oxygen species,ROS,批号:20190320)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX,批号:20190320)、过氧化氢酶(catalase,CAT,批号:20190320)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,批号:20190320)试剂盒均购自北京华英生物技术研究所。

1.3 实验仪器

752-迈瑞BS-420全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司),华卫德朗DR-200BS酶标分析仪(无锡华卫德朗仪器有限公司),neofuge 15R型冷冻离心机(heal force公司),稳豪倍易型血糖仪和血糖试纸(强生上海医疗器械有限公司,生产批号:3677941)。

1.4 动物造模、分组及给药

1.4.1 动物造模与分组 雄性SD大鼠100只,适应性喂养1周,将大鼠随机分为空白组10只和造模组90只。其中空白组给予普通饲料,造模组给予高脂饲料喂养8周。第10周,以30 mg/kg的剂量一次性腹腔注射2 % STZ溶液(现用现配,取适量链尿佐菌素,在0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冰浴中配置,pH=4.5),并于 72 小时后禁食不禁水 8 小时,尾尖静脉取血测空腹血糖,选择空腹血糖(fasting bloodglucose,FBG) >11.1 mmol /L 的成模大鼠,造模期间,造模大鼠死亡 10 只,成模 70 只。剔除空腹血糖>30 mmol /L的成模大鼠,剩余 50 只成模大鼠纳入实验。随机分为模型组,二甲双胍组,CPE 低、中、高剂量组,每组 10 只。

1.4.2 给药根据 1 mL /100 g 给药体积计算,空白组和模型组灌胃0.9 %氯化钠溶液,二甲双胍组灌胃二甲双胍混悬液(0.3 g/kg),CPE低、中、高剂量组分别灌胃青钱柳叶水提物0.25、0.5、1 g/kg,连续给药4周。给药期间各组大鼠给予普通饲料,自由进食、饮水。

1.5 空腹血糖及血清指标检测

开始给药后,每周禁食不禁水8小时,尾静脉采血测空腹血糖。给药4周结束后,禁食不禁水8小时,使用10%的水合氯醛麻醉大鼠,经腹主动脉取全血,血液经3000 r/min离心15分钟取上层血清,采用酶联免疫法测NGAL、KIM-1含量,采用比色法测CRE、UREA、CP、MDA、ROS、GSG-PX、CAT、SOD含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 CPE对2型糖尿病大鼠一般体征及FBG的影响

空白组精神状况良好,毛色有光泽,行动自如,反应灵敏;与空白组比较,模型组,毛色晦暗,行为狂躁,反应异常;与模型组比较,二甲双胍组及CPE低、中、高剂量组精神状况有所改善,行为较正常。

与空白组比较,模型组空腹血糖显著升高(P<0.05)。与模型组比较,二甲双胍组空腹血糖显著降低(P<0.05);CPE低、中、高剂量组空腹血糖显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 CPE对2型糖尿病大鼠FBG的影响

注:与空白组比较aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05。

2.2 CPE对2型糖尿病大鼠肾功的影响

与空白组比较,模型组肌酐有上升趋势,尿素氮显著升高(P<0.05)。与模型组比较,二甲双胍组肌酐、尿素氮显著降低(P<0.05);CPE低、中、高剂量组肌酐、尿素氮显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 CPE对2型糖尿病大鼠肾功的影响

注:与空白组比较aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05。

2.3 CPE对2型糖尿病大鼠肾损伤因子的影响

与空白组比较,模型组NGAL、KIM-1、CP显著升高(P<0.05)。与模型组比较,二甲双胍组NGAL、KIM-1、CP显著降低(P<0.05);CPE低、中、高剂量组NGAL、KIM-1、CP显著降低(P<0.05)。见表3。

2.4 CPE对2型糖尿病大鼠氧化应激的影响

与空白组比较,模型组MDA、ROS显著升高,(P<0.05);模型组GSG-PX、CAT、SOD显著降低(P<0.05)。与模型组比较,二甲双胍组MDA、ROS显著降低(P<0.05);CPE低、中剂量组MDA显著降低;CPE低、高剂量组ROS显著降低(P<0.05);二甲双胍组GSG-PX、SOD显著升高,CAT有升高趋势(P<0.05);CPE低、高剂量组GSG-PX显著升高;CPE高剂量组CAT显著升高;CPE低、中、高剂量组SOD显著升高(P<0.05)。见表4。

3 讨论

常规尿蛋白、血尿素氮和肌酐是判断肾脏损伤的传统指标[13],但是由于早期糖尿病肾病并没有明显的临床症状和体征,所以单凭症状和体征难以及早地发现糖尿病肾病,当血BUN、Cr升高,特别是出现大量蛋白尿时,肾损伤已经相当严重,不可逆转[14]。糖尿病肾损害的早期,良性肾小球动脉硬化尚未出现临床症状,但肾脏储备功能已经下降,肾小球和肾小管的功能和结构已发生改变[15]。研究发现,NGAL是 25 kDa 小分子量蛋白,属于脂质运载蛋白家族成员,可以由中性粒细胞和上皮细胞(包括肾小管细胞) 释放,当肾小管功能损害时,NGAL 释放入血液中,在正常白蛋白尿的极早期能够被检测到,可预测糖尿病肾损害[16]。KIM-1是跨膜蛋白,正常近端小管上皮细胞不表达,肾损伤后 KIM-1 会特异性升高,可作为肾脏近端小管损伤的生物标记物,有利于肾损伤的早期诊断[13]。CP是由肝脏合成的唯一蓝色蛋白质,是一种多铜氧化物及抗氧化剂,可反映机体急性和慢性炎症,与糖尿病肾病进展相关[17]。因此,NGAL、KIM-1、CP是肾小球硬化和肾小管间质纤维化的关键细胞因子[17-18],可作为早期肾损伤的重要生物学灵敏标志物。

本实验中,与空白组相比,模型组大鼠FBG显著升高,UREA显著升高,CRE没有显著差异但有明显升高趋势,同时模型组大鼠血清NGAL、KIM-1、CP的含量显著升高,表明2型糖尿病大鼠模型已经产生了早期的肾损伤。而其中CRE并没有统计学意义,也说明了在肾损伤早期,传统的肾功指标并不灵敏,这就需要更灵敏的标志物来预测肾损伤,从而加以预防,防止其进一步恶化最终发展为糖尿病肾病,检测NGAL、KIM-1、CP等细胞因子,对于及时发现并预防早期肾损伤具有重要意义。经过给予CPE治疗,CPE低、中、高剂量组都能显著降低FBG、CRE、UREA、NGAL、KIM-1、CP含量,表明青钱柳可以有效降低血糖,改善肾功能,降低肾损伤标志物NGAL、KIM-1、CP的含量,所以青钱柳对于2型糖尿病大鼠的早期肾损伤具有良好保护作用,能够预防糖尿病肾病。

表3 CPE对2型糖尿病大鼠肾损伤因子的影响

注:与空白组比较aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05。

表4 CPE对2型糖尿病大鼠氧化应激的影响

注:与空白组比较aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05。

2型糖尿病与机体内氧化应激的程度及抗氧化防御体系功能紊乱有关[19],持续性高血糖诱导机体产生超氧化物如MDA、ROS[20],同时高血糖还可导致抗氧化酶的糖基化,令CAT、SOD、GSH-PX 等抗氧化酶活性降低,抗氧化系统清除能力减弱,这时机体内大量的氧自由基会损伤周围正常组织蛋白和肾组织,释放NGAL、KIM-1、CP于血液中,并激活糖尿病肾病相关通路,进一步损伤肾脏,使其纤维化,此时肾功能将完全丧失,发展为终末期肾病。本实验中,与空白组相比,模型组ROS、MDA显著升高,CAT、SOD、GSH-PX显著降低,说明2型糖尿病大鼠体内氧化应激水平增强;与模型组相比,CPE低、中高剂量组不仅能显著降低ROS、MDA,还能显著升高CAT、SOD、GSH-PX。结果表明青钱柳可以缓解肾脏的氧化应激损伤,可能通过此途径发挥了早期的保护作用,从而阻碍了肾损伤的进一步恶化,但其具体的作用机制还需进一步深入研究。

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