童也，张小晴，许斌，刘晓伟

1蚌埠医学院，安徽蚌埠 233000；2东部战区总医院

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，已经成为儿童与青少年第2大癌症相关死亡因素[1]。骨肉瘤患者应用传统的手术治疗方式效果不理想且生存率低于20%。随着骨肉瘤治疗手段的不断改进，目前通过新辅助化疗联合手术的方式使患者整体生存率较以往有所提高，但5年生存率仍低于70%[2]，因此寻找新的治疗手段成为研究重点。近年研究[3～7]发现，骨肉瘤预后相关的基因主要有HER2、RB1、PTEN、EGFR、P53等。泛素羧基末端水解酶(BAP1)是泛素羧基末端水解酶家族中的成员，参与多种生物学功能，如底物的去泛素化、转录因子调控、DNA的损伤修复等。最近研究[8]发现，BAP1与肿瘤的发生发展过程高度相关，并且在肿瘤组织中主要发挥抑制作用。目前关于BAP1与骨肉瘤相关性的研究较为缺乏，2019年6～9月，本研究通过生物信息统计法分析BAP1抑制的骨肉瘤细胞芯片数据，并通过基因调控网络分析方法寻找与BAP1抑制相关的核心基因，探索BAP1在骨肉瘤中发挥的作用，为骨肉瘤的治疗方案提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 数据获取及预处理 从GEO数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载人骨肉瘤细胞系U20S原始基因芯片数据集(编号及平台文件分别为GSE58209与GPL570)。该数据集包含3例BAP1敲低的骨肉瘤细胞样本(实验组)与6例未经特殊处理的骨肉瘤细胞样本(对照组)。原始数据经R软件中Affy包读入，RMA算法对数据做标准化处理。用平台文件GPL570对标准化数据中探针信息进行注释。数据中存在多个探针对应同一个基因名的情况，通过取多个探针基因表达平均值的方法来合并探针。最后，基于最近邻居值算法(KNN)，经由R软件中Immpute包补充数据集中的缺失值。对原始数据进行处理后检测BAP1的干扰效率发现，BAP1在实验组中表达量较对照组显著降低，表明实验中研究者对BAP1的干扰是有效的。

1.2 BAP1敲低的骨肉瘤细胞中差异表达基因的筛选 预处理后的数据，使用R软件中Limma包对实验组与对照组之间的差异表达基因进行筛选。筛选条件为变化倍数 |log2(fold change)| > 1且校正后的P<0.05。

1.3 BAP1敲低的骨肉瘤细胞差异表达基因本体功能及代谢通路分析 采用R软件中clusterProfiler包[9]对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析。GO富集分析分为3个功能组分，包括分子功能、生物过程和细胞组成。在富集分析过程中，使用费舍尔精确检验(Fisher′exact test)来检验差异基因在某个网络中是否富集，设置校正后的P<0.05作为筛选条件。

1.4 BAP1敲低的骨肉瘤细胞差异表达基因蛋白互作网络分析 差异表达基因提交至STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)进行蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析，最小有效结合分数设为0.4。分析结果导入Cytoscape 3.6.1软件构建PPI网络，并使用该软件中CytoHubba插件寻找网络结构中的核心差异基因(度值最高的基因)。

2 结果

2.1 BAP1敲低的骨肉瘤细胞差异表达基因 共筛选出BAP1敲低的骨肉瘤细胞与骨肉瘤细胞的差异表达基因461个，与对照组比较，实验组中上调的差异表达基因有64个，下调的差异表达基因有397个，上调与下调差异表达基因中变化最显著的前15个基因见表1。

2.2 BAP1敲低的骨肉瘤细胞差异基因生物学功能及代谢通路 BAP1敲低的骨肉瘤细胞与骨肉瘤细胞差异表达基因主要参与DNA复制、核分裂和细胞器裂变等生物学过程；差异表达基因主要定位于纺锤体和染色体区域；差异表达基因的主要分子功能有DNA复制起始点结合与作用于DNA的催化活性。KEGG通路富集分析结果表明，共有5条代谢通路被富集到，富集分析最有意义的代谢通路与细胞周期、DNA复制有关。

2.3 BAP1敲低的骨肉瘤细胞核心差异表达基因 BAP1敲低的骨肉瘤细胞与骨肉瘤细胞差异表达基因PPI网络见图1。PPI网络拓扑结构中的度值最高的前10个基因从高到底分别为CDK1(分值：105)、CDC6(分值：88)、TOP2A(分值：87)、CDC45(分值：85)、MCM2(分值：81)、NCAPG(分值：80)、EXO1(分值：80)、NDC80(分值：79)、RFC4(分值：79)、DTL(分值：78)，这些基因为核心差异基因，最核心差异基因为CDK1，见图2。10个核心差异基因在实验组与对照组之间的差异表达情况见表2。

表1 符合纳入条件的上调及下调表达的前15位mRNA

注：★代表上调的基因。

图1 BAP1敲低的骨肉瘤细胞差异表达基因PPI网络

图2 PPI网络中的核心差异基因

表2 实验组与对照组间的10个核心差异基因

3 讨论

BAP1是泛素羧基末端水解酶家族中的一员，去除底物蛋白的泛素化修饰是其基本功能。BAP1还可以通过依赖或不依赖其去泛素化功能调节细胞周期、细胞分化、基因表达、细胞凋亡和DNA损伤应答等。最近研究[10]发现，BAP1在多种肿瘤中发挥肿瘤抑制作用，BAP1突变导致该基因的功能缺失容易引发恶性肿瘤综合征。也有研究[11，12]表明，在恶性间皮瘤与侵袭性脑膜瘤中，BAP1被检测到处于等位基因失活状态，提示BAP1在肿瘤的发生、发展过程中扮演了重要角色，BAP1基因突变或者功能失活会提高肿瘤的发生率。

SPINK6属于Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，通过调节丝氨酸蛋白酶的活性对人体内的蛋白质代谢产生影响，在各种生理、病理过程中起到重要的调控作用[13]。Zheng等[14]研究发现，SPINK6 mRNA在肿瘤和高度转移的鼻咽癌细胞中表达量上调，异位SPINK6表达提高了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力，促进了鼻咽癌细胞的体内淋巴结转移和肝脏转移。本研究结果显示，骨肉瘤细胞与BAP1敲低的骨肉瘤细胞的差异表达基因中，SPINK6上调最为显著。表明骨肉瘤细胞在BAP1抑制的条件下，可能会引发SPINK6表达的上调，从而提高肿瘤细胞的侵袭能力，导致骨肉瘤患者预后不良。CNN1即钙调蛋白1，参与调控平滑肌的收缩与细胞增殖。既往研究[15～17]发现，CNN1在多种肿瘤组织中下调，CNN1的正常表达可以抑制肿瘤的增殖与侵袭能力。本研究中筛选出的BAP1抑制的骨肉瘤细胞与骨肉瘤细胞的差异表达基因中CNN1显著下调，进一步印证了CNN1对肿瘤细胞的增殖抑制作用，提示CNN1有望成为骨肉瘤患者的预后标志物。

对BAP1敲低的骨肉瘤细胞和骨肉瘤细胞的差异表达基因进行GO富集分析，结果表明差异表达基因主要参与的生物学过程有DNA复制、核分裂和细胞器裂变。KEGG通路富集分析结果显示富集分析最有意义的代谢通路与细胞周期、DNA复制有关。提示BAP1在骨肉瘤细胞中受抑制的情况下，主要通过影响骨肉瘤细胞分裂、DNA复制以及细胞周期从而对骨肉瘤的进展产生一定的影响。

为了寻找在BAP1抑制条件下骨肉瘤细胞中较为重要的差异基因，在STRING数据库和Cytoscape软件中构建了差异表达基因PPI网络，并找出该网络拓扑结构中的核心差异基因，度值前10位的基因从高到低分别为CDK1、CDC6、TOP2A、CDC45、MCM2、NCAPG、EXO1、NDC80、RFC4、DTL，其中度值最高的核心差异基因是CDK1。CDK1是细胞周期蛋白依赖性激酶1，同时也是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，在真核细胞周期的 G1/S 和 G2/M 期转变过程中发挥重要作用[18]。CDK1可能通过促进肿瘤细胞的有丝分裂以及细胞周期的过程，激活相关癌症通路，影响骨肉瘤患者的疾病进程。本研究发现，CDK1在经过BAP1抑制后，是下调的。提示，在BAP1抑制条件下，骨肉瘤细胞CDK1表达同时下调，二者协同影响骨肉瘤的发生、发展。

综上所述，BAP1敲低的骨肉瘤细胞与骨肉瘤细胞中差异表达基因共461个，其中64个差异基因表达上调、397个差异基因表达下调。差异表达基因主要参与DNA复制、核分裂和细胞器裂变等生物学过程，影响细胞周期和DNA复制等相关代谢通路。BAP1敲低的骨肉瘤细胞中的核心差异基因为CDK1。进一步的研究将观察核心差异基因在其他BAP1抑制的人骨肉瘤数据集中的表达以验证当前研究结果的可靠性；结合骨肉瘤的临床数据与二代测序数据，通过临床预测模型来进一步分析BAP1与骨肉瘤的预后相关性，为进一步揭示BAP1在骨肉瘤中所扮演的角色提供有价值的基础工作。