汤云飞，苏晨，高学军，崔英俊

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）

0 引 言

基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP9）是一种锌依赖性酶[1]，是MMP蛋白家族的成员。MMP家族在组织重塑，器官发育[2]，癌细胞增殖及迁移[3-4]，降解细胞外基质[5]、控制细胞生长[6]、炎症或血管生成[7]等生理过程中发挥至关重要的作用。正常乳腺发育的不同阶段需要细胞外基质精细控制的降解和重塑，MMP9被认为是其中的关键酶[8]。MMP9在影响乳腺结构的同时，对乳腺泌乳是否有影响还未见报道。

本研究利用MMP9过表达载体或干扰片段转染奶牛乳腺上皮细胞，然后分别检测奶牛乳腺上皮细胞的β-酪蛋白表达、乳脂含量，以及细胞增殖情况。旨在通过本实验确认MMP9是否影响奶牛乳腺上皮细胞泌乳。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验室保存的奶牛乳腺上皮细胞，MMP9过表达质粒（p-31质粒，博仕公司），MMP9干扰片段（苏州吉玛），甘油三酯试剂盒（普利莱e1013），MTT试剂盒（碧云天c0009），Lipofectamine 2000（Invitrogen），组织RNA微量提取试剂盒（美吉，R 4114-02），TB Green试剂盒（Takara，rr820a），Abi7500实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems），DU 640紫外分光光度计（Beckman）。

1.2 研究方法

1.2.1 转染

将奶牛乳腺上皮细胞传至6孔板。过表达实验设对照组、过表达阴性对照组（加pcDNA3.1空质粒）、MMP9过表达组（加MMP9过表达载体）三组；抑制实验设对照组、抑制阴性对照组（加入干扰片段阴性对照）、MMP9抑制组（加MMP9干扰片段）三组。在细胞长至70%左右时按照以上分组进行转染，24 h后收集各组样品。

1.2.2 荧光定量PCR

用RNA提取试剂盒提取mRNA后，进行反转录。按照TB Green试剂盒说明书在冰盒上配制20 uL体系反应液，使用两步法进行荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）。MMP9引物（5’-3’GGTGCTGGCTTGCTGCTCTG，TTGGTGAGGTTGGTTCGTGGTTC）、β-酪蛋白……