刘欢苇 张 舒 邓 迪 毛 钦 郭 锐 吴 珺 郝 钰

(北京中医药大学生命科学学院免疫与微生物学系,北京 102488)

犀角地黄汤合银翘散(Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder,XDY)源自吴鞠通《温病条辨·上焦篇》，银翘散清解卫分之毒，犀角地黄汤解营血毒，两方相合可达清热解毒、凉血止血、化瘀通络之效，先证用药，截断病势。前期动物实验证明：XDY可明显降低病毒性肺炎模型小鼠体内炎性因子和肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白细胞总数，改善肺指数、肺病理改变，降低肺血管通透性，下调肺组织中细胞间黏附分子(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-l)和血管细胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-l)的表达[1-3]。但XDY对病毒诱导肺血管通透性增加的影响和机制还未阐明。

PMVEC与肺泡上皮细胞共同构成肺泡-毛细血管屏障，F-actin变化会直接影响其骨架完整性并造成通透性改变[4]，在病毒性肺炎发生过程中，PKC通路被激活，其下游底物SSeCKS由在正常细胞内散在分布转移至细胞核周和细胞皱褶处并诱导F-actin变构形成丝状应力纤维[4，5]，导致PMVEC通透性增加，屏障功能下降，细胞和含蛋白的液体渗出增多，形成肺水肿[6]。

因此，本研究将观察XDY对流感病毒诱导的PMVEC通透性改变和对PKC-SSeCKS介导的F-actin变构的影响，以探讨XDY治疗病毒性肺炎的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 根据陈瑞华等[7]的方法进行大鼠PMVEC原代培养和鉴定。

1.1.2病毒 流感病毒甲型鼠肺适应株A/FM/1/34(H1N1)(FM1)，中国预防医学科学院病毒学研究所提供，-70℃保存。鸡胚尿囊腔中传代两次后，收集尿囊液。用微量血凝试验(HA)检测病毒血凝效价为1∶512，病毒感染MDCK细胞24、48、72 h后，采用Reed-Muench法计算TCID50。流感病毒FM1的TCID50为10～4.6/0.1 L。

1.1.3药物 犀角地黄汤合银翘散(水牛角30 g、生地30 g、芍药12 g、丹皮9 g、连翘9 g、银花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹4 g、生甘草5 g、荆芥穗5 g、淡豆豉5 g、牛蒡子9 g) 购自北京同仁堂药店，制成水煎剂。根据张晨月等[2]的方法和剂量制备含药血清。

1.1.4主要试剂和仪器 M199 培养基和胎牛血清(HyClone)；双抗(Solarbio)；ECGS(BD);PKC活性检测试剂盒(Promega);PKC抑制剂(Midostaurin);绵羊抗大鼠SSeCKS 抗体(Sigma)；TRITC标记的兔抗绵羊IgG(Jackson)；FITC-鬼笔环肽(Molecular Probes)；跨膜电阻仪(Millipore MERS00002)。

1.2方法

1.2.1内皮细胞通透性的检测 将大鼠PMVEC(2×105cells) 接种于0.5% 明胶包被的Transwell 小室内，上、下室分别加入0.5 ml和1.5 ml M199 完全培养液，细胞达单层融合后，设置对照组、模型组(100TCID50FM1)、PKC抑制剂组(100TCID50FM1+10 μmol/L PKC抑制剂)和XDY组(100TCID50FM1+15%XDY含药血清)。将跨膜电阻仪调至欧姆档，将2个STX-2电极分别置于Transwell小室表面和下室内，于24 h测量各组阻抗值，并测未接种细胞的小室阻抗值，每室重复3次。TER= (测得阻抗值-空白阻抗值)× Transwell小室的底面积，单位为Ω·cm2。TER反映溶质离子传递电流的强弱，与细胞通透性呈反比。

1.2.2PKC活性的检测 设置对照组、模型组、PKC 抑制剂组和XDY组。干预因素作用24 h后将各组细胞收集并匀浆，离心(4℃,14 000 r/min,5 min)取上清，按PKC活性检测试剂盒操作说明测定上清液的PKC 活性，电泳检测时，同一泳道条带的灰度比值反映上清液中PKC 激酶活性。

1.2.3SSeCKS的mRNA和蛋白表达检测 设置对照组、模型组和XDY组，干预因素作用24 h，收集细胞，按RNeasy Mini kit试剂盒说明书提取细胞总RNA，用TE10倍稀释。根据GenBank 提供的SSeCKS 基因已知序列(AY695056),用Primer Premier 5.0软件设计CDS区的上游引物序列为5′-AATCCATCCCAATCATAGTAAC-3′,下游引物序列为5′-TCTCAAGGTCCCAACAGC-3′，内参GAPDH 的上游引物序列为5′-ATGACCCCTTCATTGACC-3′,下游引物序列为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR扩增按One-Step SYBR PrimeScript PT-PCR KitⅡ试剂盒说明书进行，结果以2-ΔΔCt表示。收集细胞，用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量。用Western blot 方法检测SSeCKS 蛋白表达量。

1.2.4激光共聚焦显微镜观察SSeCKS和F-actin在细胞内的定位和结构的改变 将5×108cells/L 的细胞100 μl种于激光共聚焦专用96孔板内，分组如上，干预因素作用24 h后，置于4%多聚甲醛中4℃固定1 h，以1% Triton X-100进行膜通透10 min，PBS清洗后，加正常兔血清室温封闭1 h，倾去。SSeCKS用抗SSeCKS抗体4℃孵育过夜，洗涤后避光，以TRITIC荧光Ⅱ抗4℃孵育1 h；F-actin用FITC-鬼笔环肽染色，洗涤，封片，在激光共聚焦显微镜下观察。每个样品设3个复孔，进行3次独立实验。

2 结果

2.1XDY对流感病毒感染大鼠PMVEC通透性的影响 病毒作用于PMVEC 12 h左右TER开始下降，24 h下降最明显(图1A)，因此本研究选取24 h作为XDY含药血清干预时间点。干预因素作用24 h 时，与对照组相比，模型组TER降低(P<0.01)；与模型组相比，PKC抑制剂组与XDY组TER明显增高(P<0.01)，见图1B。

2.2XDY对流感病毒感染大鼠PMVEC后PKC活性的影响 干预因素作用24 h后，与对照组相比，模型组PKC活性增强 (P<0.01)；与模型组相比，PKC抑制剂组和XDY组PKC活性降低(P<0.01) ，见图2A、B。

图1 大鼠PMVEC通透性的变化Fig.1 Change of rat TER of PMVECNote:A.Change of TER of PMVEC infected by influenza virus at different time points;B.Effect of XDY on TER of PMVEC infected by influenza virus Control;##.P<0.01,vs Model.

图2 XDY对流感病毒感染大鼠PMVEC后PKC活性的影响Fig.2 Effect of XDY on activity of PKC of PMVEC infected by influenza Note:1.Control；2.Model；3.PKC inhibitor；4.XDY.**.P<0.01,vs Control;##.P<0.01,vs Model.

2.3XDY对流感病毒感染大鼠PMVEC后SSeCKS mRNA、蛋白表达和定位的影响 干预因素作用24 h后，模型组SSeCKS mRNA表达比对照组明显增多 (P<0.05)；与模型组比，XDY组SSeCKS mRNA的表达明显降低 (P<0.05)，见图3A。流感病毒感染大鼠PMVEC 24 h后，模型组SSeCKS蛋白表达量明显增多；与模型组比，XDY组SSeCKS的蛋白表达明显降低，见图3B。激光共聚焦显微镜下显示，对照组PMVEC中SSeCKS均匀分布在细胞中；而模型组SSeCKS集中分布于核周；XYD组可明显改善模型组SSeCKS分布情况，趋于正常，见图3C。

2.4XDY对流感病毒感染大鼠PMVEC后F-actin在细胞内的定位和结构改变的影响 对照组PMVEC中F-actin主要分布在细胞周边和核周，微丝微管分布均匀、排列整齐,胞周可见F-actin形成的致密周围束；与对照组相比，模型组细胞周边的F-actin致密束基本消失，形成应力纤维；与模型组相比，XDY的PMVEC在病毒作用后细胞骨架基本完整，可见F-actin分布于细胞周边的致密周围束，趋于正常，见图4。

图3 XDY对病毒感染大鼠PMVEC后SSeCKS mRNA、蛋白表达和定位的影响Fig.3 Effect of XDY on expression of SSeCKS mRNA and protein and its location in PMVEC infected by influenza virusNote:A.SSeCKS mRNA protein expression;C.SSeCKS location in PMVEC.*.P<0.05,vs Control;#.P<0.05,vs Model.

图4 XDY对流感病毒感染大鼠PMVEC后F-actin分布和结构的影响(激光共聚焦显微镜)Fig.4 Effect of XDY on distribution and structure of F-actin in PMVEC infected by influenza virus(Laser scanning confocal microscopy)

3 讨论

病毒性肺炎发生时，严重的炎症反应可导致急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，是影响患者预后和明显增加死亡率的危险因素[8]。PMVEC通透性改变是发生ARDS的重要环节[9]，前期动物实验结果提示，流感病毒感染的肺炎小鼠肺血管通透性升高，肺间质炎性渗出增多，肺指数升高；XDY可使肺炎小鼠肺组织通透性降低，渗出减少，肺指数降低。PMVEC是构成肺血管屏障的主要细胞，我们用原代培养的大鼠PMVEC为模型，采用跨膜电阻仪监测PMVEC的TER以观察其通透性变化，结果表明XDY可显著抑制流感病毒诱导的PMVEC通透性增加。同时发现，流感病毒感染的 PMVEC中PKC活性明显增强，特异性PKC抑制剂可显著抑制PMVEC中PKC活性并显著抑制其通透性增加，说明流感病毒诱导的PMVEC通透性增加依赖PKC介导的信号通路。Src抑制蛋白激酶C的底物(SSeCK)是一种表达于血管内皮细胞的支架蛋白，相对分子量为280～290 kD，在急性肺损伤中作为炎症反应蛋白过度表达[10]。

SSeCK是PKC的结合蛋白也是其底物，可以通过与PKC选择性结合，破坏内皮细胞通透性稳定状态[10]。体外培养过度表达异源性SSeCKS的成纤维细胞中发现纤维状肌动蛋白、纽蛋白相关的细胞黏着斑缺失和细胞伪足样突起的形成[5]。PKC信号通路激活后，其底物SSeCKS可诱导F-actin应力纤维的形成，紧密连接、黏附连接和内皮细胞-细胞外基质解聚，使PMVEC通透性增加，进而触发级联反应并放大肺部炎症反应[10]，诱发ARDS。F-actin是构成内皮细胞骨架的主要成分，其变化直接影响PMVEC通透性。内皮细胞受到炎性介质刺激后，F-actin发生变构：球状肌动蛋白聚合形成丝状肌动蛋白，位于细胞膜附近的致密周围束消失,形成应力纤维,导致细胞强烈收缩[4]，而SSeCKS由在正常细胞内散在分布转移至细胞核周和细胞皱折处，最终导致细胞形态改变，细胞收缩，增大、增多细胞间的缝隙,使PMVEC通透性增加[5]。

本研究结果显示，流感病毒感染PMVEC后，细胞中PKC活性增强，同时SSeCKS mRNA和蛋白表达增加，SSeCKS在细胞中的定位由在细胞内散在均匀分布变为集中于核周，而细胞内F-actin在细胞周边形成的致密周围束消失，微丝微管排列紊乱甚至消失，说明流感病毒感染所致PMVEC通透性增加与PKC-SSeCKS通路密切相关；XDY干预可使流感病毒感染后PMVEC中PKC活性降低，SSeCKS mRNA和蛋白表达减少，同时可见SSeCK在细胞中散在均匀分布，而细胞内F-actin在细胞周边的致密周围束又复出现，F-actin的变构被逆转。以上结果说明，XDY可下调流感病毒激活的PKC-SSeCKS信号通路，降低SSeCKS的表达，减轻下游F-actin致密周围束解聚的变构现象，阻止细胞收缩导致的细胞间隙增大，从而抑制流感病毒性肺炎中流感病毒引起的PMVEC通透性增高，缓解内皮细胞的损伤，减轻炎症。

“毒损肺络”是现代医家在卫气营血传变规律的基础上结合现代解剖学和病理学提出的病因病机学说。张伟等[11]将中医学说的毒分内外，外毒为六淫、戾气和环境毒邪等，致病途径包括五官九窍和腠理经络等与外界接触的部位；内毒的致病途径有机体代谢异常、五情失常和病理产物。肺络布散于整个肺组织，分为气络和血络，分别与解剖学中的气管、支气管和肺内毛细血管对应[12]。流感病毒是引起病毒性肺炎的最常见病原，属外毒范畴，PMVEC属肺之血络，其通透性改变是病毒性肺炎的一个重要病理变化，也是引起ARD的主要原因[9]，因此，病毒性肺炎属“毒损肺络”范畴，治疗病毒性肺炎应注重解毒与通络，银翘散可清解卫分毒，去除损害因素，犀角地黄汤清解营血分毒并化瘀通络，两方合用疗效甚佳[13]。本实验研究证明，XDY改善流感病毒感染所致的肺微血管通透性增加，是其清热解毒、凉血止血、化瘀通络的生物学基础之一。