杨 玉 王 艳 姜晶晶 段强军 邵 菁 汪天明 汪长中

(安徽中医药大学，合肥 230012)

炎症小体(Inflammasome)是一类由胞浆内模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)参与组装的多蛋白复合体，在感染性疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病等多种疾病中扮演着重要的角色。其中，NLRP3炎症小体是迄今为止结构和功能研究得最为明确的炎症小体，其在抗感染天然免疫中的作用近年来受到高度关注[1，2]。

外阴阴道念珠菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是女性生殖道中最常见的真菌感染性疾病。最新研究表明，VVC时，白念珠菌与巨噬细胞相互作用，通过TLR4/NF-κB通路激活NLRP3炎症小体，产生过量的炎症因子IL-1β和IL-18，造成阴道黏膜免疫炎症性损伤。因此，NLRP3炎症小体被认为是治疗VVC的一个重要靶标[3]。研究显示，许多中药对NLRP3炎症小体的活化具有调节作用[4]，本课题组近年来致力于中药抗VVC研究，发现中药复方白头翁汤正丁醇提取物对VVC模型小鼠有显著的治疗作用[5]。盐酸小檗碱是白头翁汤正丁醇提取物中含量最多的有效成分[6]，但盐酸小檗碱能否对VVC时的NLRP3炎症小体发挥抑制作用？本实验拟观察盐酸小檗碱对白念珠菌刺激下巨噬细胞NLRP3炎症小体及TLR4/NF-κB通路的影响，从炎症小体角度阐明白头翁汤正丁醇提取物抗VVC的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人单核细胞白血病细胞(THP-1细胞)购自中国科学研究院上海细胞库；白念珠菌标准株SC5314由解放军第二军医大学姜远英教授提供；FITC-小鼠抗人CD68抗体，批号：11-0689-41购自invitrogen公司；盐酸小檗碱，批号：MUST-18081510购自成都曼斯特生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，批号：ATSFE1401购自Abbkine公司；RPMI1640，批号：AE26543277购自Hyclone公司；胎牛血清,批号：JC53576购自Clarkbio公司；PMA，批号：P1585购自Sigma公司；IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒，批号：201812购自上海一研生物科技有限公司；β-actin抗体，批号：12w2944，TLR4抗体，批号：16c5074，Pro-caspase1抗体，批号：AF5418均购自Affinity公司；ASC抗体，批号：ATSAP1701购自Abbkine公司；MyD88抗体,批号：GR3183101-3购自Abcam公司；NF-κB抗体，批号：8242t，NLRP3抗体，批号：15101s，Cleaved Caspase1抗体，批号：4199t均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1巨噬细胞的诱导及鉴定[7]在含10% FBS的RPMI1640培养基的6孔板中，按8×105ml-1密度接种THP-1细胞，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中，倒置显微镜下每天观察细胞悬浮生长情况。除正常组外，其他加入100 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)作用24 h；倒置显微镜下观察细胞形态，收集细胞，用PBS清洗后，室温固定15 min，用PBS清洗2次，破膜及加抗人CD68抗体，4℃避光孵育30 min。洗涤2次后加入500 μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测巨噬细胞的分子标志。

1.2.2白念珠菌最佳浓度的检测 在诱导成功的巨噬细胞中，加入100 μl终浓度分别为0、2.5×106CFU/ml、2×106CFU/ml、1.5×106CFU/ml、1×106CFU/ml、8×105CFU/ml、5×105CFU/ml的白念珠菌。每孔加入10 μl的CCK-8，1 h后酶标仪测定450 nm下各孔的吸光度值；同时，选取比较有代表性的白念珠菌的浓度与诱导成功的巨噬细胞共培养4 h，在倒置显微镜下观察白念珠菌对巨噬细胞形态的影响。

1.2.3盐酸小檗碱安全浓度的检测 在诱导成功的巨噬细胞中，加入100 μl终浓度分别为0、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml的盐酸小檗碱，培养4 h后，每孔加入10 μl的CCK-8，1 h后酶标仪测定450 nm波长下各孔的吸光度值。

1.2.4盐酸小檗碱对白念珠菌刺激下巨噬细胞NLRP3炎症小体影响的检测

1.2.4.1ELISA检测IL-1β、IL-18表达水平 将诱导成功的巨噬细胞分为3组：正常对照组、模型组、给药组。正常对照组只含巨噬细胞；模型组包含巨噬细胞以及白念珠菌(1.5×106CFU/ml)；给药组：在模型组基础上加入终浓度为16 μg/ml的盐酸小檗碱，培养4 h 。取上清液，按ELISA试剂盒说明书测定IL-1β、IL-18。

1.2.4.2Western blot法检测TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Cleaved Caspase1蛋白的表达 巨噬细胞及分组同1.2.4.1。用质量分数为10%及12%的SDS-PAGE分离，湿转膜法转到 PVDF膜上，封闭2 h，TBST洗涤3次，每次10 min。加入一抗β-actin(兔抗，1∶1 000)、TLR4(兔抗，1∶1 000)、MyD88(兔抗，1∶1 000)、NF-κB(兔抗，1∶1 000)、NLRP3(兔抗，1∶800)、ASC(兔抗，1∶1 000)、Pro-caspase1(兔抗，1∶1 200)、Cleaved Caspase1(兔抗，1∶800)，4℃冰箱孵育过夜后，TBST洗涤3次，每次10 min。加入相应的二抗(羊抗兔，1∶20 000)孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用ECL显影曝光。

2 结果

2.1巨噬细胞的诱导情况 如图1所示，图1A为THP-1细胞，呈悬浮状，圆而小，折光率好。图1B为THP-1细胞经PMA作用24 h后诱导分化成巨噬细胞，呈贴壁生长，体积较大，呈簇状聚集，大多数细胞有伪足伸出。

CD68为人巨噬细胞重要标志分子。如图2所示，通过流式细胞术可以观察到THP1细胞经100 ng/ml PMA处理24 h后，细胞CD68分子的表达量明显增加。

图1 倒置显微镜下观察THP1细胞及经PMA诱导的巨噬细胞(×200) Fig.1 THP1 cells and macrophages induced by PMA(×200)Note:A.THP1 cells;B.Macrophages induced by 100 ng/ml PMA for 24 h.

2.2白念珠菌最佳浓度的确定 如图3、4所示，与正常对照组比较，随着白念珠菌浓度的递增，巨噬细胞的存活率逐渐降低，当白念珠菌浓度为1.5×106CFU/ml时，巨噬细胞的存活率50%左右。实验选择1.5×106CFU/ml作为白念珠菌造模浓度。

2.3盐酸小檗碱安全浓度的确定 如图5所示，与正常组比较，盐酸小檗碱终浓度为32 μg/ml及64 μg/ml 时细胞活力显著降低，而终浓度在4、8和16 μg/ml时对细胞活力影响相对较小。本实验选取16 μg/ml的盐酸小檗碱为供试药。

2.4盐酸小檗碱对白念珠菌刺激下巨噬细胞NLRP3炎症小体表达的影响

图2 流式细胞术分析THP-1细胞及PMA诱导的巨噬细胞的CD68表达Fig.2 Flow cytometry analysis of CD68 expression in THP-1 cells and PMA-induced macrophagesNote:The red curve represents THP-1 cells;the blue curve represents PMA-induced macrophages.Compared with the THP-1 group,**.P<0.01.

图3 不同浓度白念珠菌对巨噬细胞活力的影响Fig.3 Effect of different concentrations of C.albicans on macrophage Note:Compared with the normal group,**.P<0.01.

2.4.1盐酸小檗碱对白念珠菌刺激巨噬细胞后IL-1β、IL-18表达水平 如图6所示，模型组IL-1β、IL-18的分泌明显高于正常组，给予16 μg/ml盐酸小檗碱后IL-1β、IL-18分泌显著降低(P<0.01)。

2.4.2盐酸小檗碱对白念珠菌刺激下巨噬细胞TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase1、Cleaved Caspase1蛋白表达的影响 如图7所示，与正常组相比，模型组TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase1、Cleaved Caspase1蛋白表达均显著升高；与模型组相比，16 μg/ml盐酸小檗碱干预后，TLR4、NF-κB、NLRP3、Cleaved Caspase1表达明显下调(P<0.05)，但MyD88、ASC、Pro-caspase1无明显变化。

图4 倒置显微镜下观察白念珠菌与巨噬细胞共培养(×200)Fig.4 Coculture of C.albicans and macrophages obser-ved by inverted microscope(×200)Note:A.Macrophages;B,C and D.Macrophages co-cultured with C.albicans at final concentrations of 5×106,1.5×106 and 2.5×106 CFU/ml,respectively.Morphology under the microspcope confirmed that 1.5×106 CFU/ml of C.albicans showed obvious hyphae.

图5 盐酸小檗碱安全浓度筛选Fig.5 Screening of safe concentration of berberine hydrochloride Note:Compared with the normal group,*.P<0.05,**.P<0.01.

图6 盐酸小檗碱对白念珠菌刺激下巨噬细胞IL-1β、IL-18分泌水平的影响Fig.6 Effect of berberine hydrochloride on IL-1β、IL-18 secretion from macrophages by Candida albicans Note:Compared with the normal group,**.P<0.01;compared with the model group，##.P<0.01.

图7 盐酸小檗碱对白念珠菌刺激下巨噬细胞NLRP3及TLR/NF-κB通路蛋白表达水平的影响Fig.7 Effect of berberine hydrochloride on expression of NLRP3 inflammasome and TLR4/NF-κB signaling pathway when macrophages stimulated by Note:Compared with the normal group,*.P<0.05,**.P<0.01;compared with the model group #.P<0.05.

3 讨论

白念珠菌是酵母-菌丝二相性真菌。外阴阴道念珠菌病(VVC)发生时，白念珠菌须由酵母相转化为菌丝相，菌丝穿过阴道上皮细胞或者从细胞间隙进入黏膜下，与趋化至黏膜下的巨噬细胞相互作用[8]。巨噬细胞表面的TLR4等受体识别菌丝表面的β-葡聚糖等病原相关分子模式(PAMPs)，经MyD88促进转录因子NF-κB介导IL-1β与IL-18前体的产生；同时促进NLRP3/ASC/Pro-caspase1蛋白复合体组装，Pro-caspase1自剪切成活化形式，活化的caspase1将IL-1β与IL-18前体剪切活化释放至胞外[9，10]。在NLRP3炎症小体活化过程中，TLR4/NF-κB通路发挥了重要的调控作用，激活物对NLRP3炎症小体的影响往往都涉及对该通路的作用，因此，寻找或研发针对该通路及其调控的NLRP3炎症小体的药物对于治疗NLRP3炎症小体相关的疾病具有积极意义。研究证实，VVC的发生与NLRP3炎症小体形成密切相关[3]，且还发现，VVC患者阴道分泌物的IL-1β显著高于正常组，若给予NLRP3抑制剂格列苯脲，则IL-1β的分泌量会大大降低[11]。因此，药物抑制NLRP3炎症小体活化以控制炎症因子IL-1β的分泌成为治疗VVC的一个重要策略。

本实验通过形态学观察结合流式细胞术证实，THP1细胞在PMA作用下成功诱导分化为巨噬细胞，用含FBS的RPMI1640培养基作用4 h，容易将白念珠菌从酵母相诱导成菌丝相，而巨噬细胞只被菌丝相而非酵母相的白念珠菌刺激才可以产生NLRP3炎症小体[12]。

实验中，CCK8法筛选出与巨噬细胞共培养4 h的白念珠菌的最宜浓度为1.5×106CFU/ml，盐酸小檗碱的安全用药浓度范围为4～16 μg/ml，并以16 μg/ml 浓度的盐酸小檗碱作为干预药物。

实验发现，巨噬细胞在白念珠菌刺激下，ELISA检测出的炎症因子IL-1β、IL-18以及Western blot 显示的TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、ASC、Pro-caspase1、Cleaved Caspase1蛋白表达水平较高，而16 μg/ml 浓度的盐酸小檗碱干预后，除了MyD88、ASC、Pro-caspase1无明显变化外，IL-1β、IL-18、TLR4、NF-κB、NLRP3、Cleaved Caspase1表达水平均显著降低，提示盐酸小檗碱可能对TLR4/NF-κB通路及其介导的NLRP3炎症小体发挥了下调作用，这也可能是以盐酸小檗碱为主要组分的白头翁汤正丁醇提取物治疗VVC小鼠的作用机制之一。

实际上，盐酸小檗碱对白念珠菌也具有一定的直接抗菌作用。包括本课题组在内的多个研究小组发现，盐酸小檗碱单独或与氟康唑等药物联用对白念珠菌均显示较强的抗菌作用[13-15]。但这些研究都是侧重于体外环境中进行的盐酸小檗碱的直接抗菌作用。而在宿主发生真菌感染时，往往涉及病原体与宿主间的相互作用，此时，宿主整体的免疫应答也发挥了重要作用。相较于适应性免疫而言，固有免疫在抗真菌感染过程中的作用更加重要，而炎症小体就是固有免疫的重要组成部分。但问题是，在VVC及其他相关疾病中，NLRP3炎症小体往往存在活化时产生过多的炎症因子IL-1β和IL-18，导致靶器官或靶组织的免疫炎症性损伤。因此，合适的药物调控NLRP3炎症小体及相应的TLR4/NF-κB通路很有必要。本研究即初步阐明了盐酸小檗碱通过该通路而发挥其下调NLRP3炎症小体的机制。

最新研究发现，阴道、口腔等黏膜发生白念珠菌感染时，菌丝能分泌一种重要的肽毒素——candidalysin，此种毒素为菌丝特异性基因ECE1表达的产物，可以激发巨噬细胞NLRP3炎症小体，产生过多IL-1β，在黏膜感染时发挥损伤作用[12，16]。本研究中，盐酸小檗碱主要是针对体外白念珠菌刺激下巨噬细胞NLRP3炎症小体产生的影响，是否对体内黏膜白念珠菌感染状态下由candidalysin活化的NLRP3炎症小体也产生同样的影响尚待进一步研究。