王海波 史有阳 冯 俊 倪腾洋 金 凤 戴小军 钱亚云 砂川正隆 刘延庆

(扬州大学医学院，扬州 225001)

痛风是长期嘌呤代谢障碍、尿酸排泄减少，血尿酸增高而引起组织损伤的一组临床综合征[1]。临床上以高尿酸血症同时伴有关节的红、肿、热、痛和关节活动不利等临床特征[2,3]。近年来，随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的改变，我国痛风的发病率呈现低龄化和上升的趋势[4]，高尿酸血症和痛风已成为我国中老年男性的常见病[5，6]。其主要特征是尿酸盐晶体沉积所致的相关性关节病，该病的发生与高尿酸血症直接相关，高尿酸血症是痛风发病最重要的生化基础[7]。因此痛风的治疗根本在于降低血尿酸的水平，同时对临床症状进行治标[8]。目前，治疗痛风与高尿酸血症仍以西药为主，通常选用别嘌呤醇或者秋水仙碱等[9-11]。这些药物虽然可以短期内有效缓解或治疗高尿酸血症与痛风，但是其毒副作用如呕吐、恶心以及痉挛性腹痛等也很明显[12-14]。而且通常只能短期缓解痛风的临床症状，并不能从根本上彻底治愈痛风。因此，寻找和开发更为有效而毒副作用更低的抗痛风和高尿酸血症的药物显得尤为重要与急迫。近年来，国内外不少临床研究表明，中医药治疗痛风能够取得明显的疗效[15-17]。此外，针对痛风发病机制、临床症状和并发症的药物研究也证明了中医药治疗痛风和高尿酸血症的确切疗效[18，19]。结果表明，中医药防治高尿酸血症具有副作用少和整体疗效明显等优势，而且可以长期服用，易被患者接受。本实验研究的复方取自刘延庆教授长期治疗痛风和高尿酸血症的临床经验方，具有丰富的临床有效样本积累；并且该复方用于治疗痛风已获得国家发明专利授权(专利号：201610960451.9)。

本实验主要通过模型动物的体内实验研究，证实该复方的确切疗效和相应的有效炎症分子靶点，同时验证该复方短期服用后的肝肾毒性，为寻找和开发高效低毒的治疗痛风和高尿酸血症的药物提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验用中药 土茯苓(规格：1 kg，厂家：安徽惠隆中药饮片有限责任公司，生产批号：20140326，产地：广西)；鬼箭羽(规格：1 kg，厂家：安徽惠隆中药饮片有限责任公司，生产批号：20150321，产地：浙江)；生苡仁(规格：1 kg，厂家：苏州市天灵中药饮片有限责任公司，生产批号：150319010，产地：江苏)；徐长卿(规格：1 kg，厂家：安徽惠隆中药饮片有限责任公司，生产批号：20141224，产地：山东)。

1.1.2试剂 秋水仙碱(阳性对照药)(规格：0.5 mg，厂家：西双版纳版纳药业有限责任公司，生产批号：150208)；生理盐水 (NS)(规格：250 ml，厂家：四川科伦药业股份有限公司)；尿酸钠晶体(MSU)(规格：15 mg，厂家：Sigma，货号：U2875)；腺嘌呤(Adenine)(规格：25 g，厂家：Sigma，货号：A8626)；氧嗪酸钾盐(Oxonic acid potassium salt)(规格：25 g，厂家：Sigma，货号：156124)；羧甲基纤维素钠 (Sodium carboxymethyl cellulose) (规格：100 g，厂家：Sigma，货号：419273)；定制高酵母饲料(规格：2 kg，厂家：江苏省协同医药生物工程有限公司，质量分数0.1)。

1.1.3实验用动物 Wistar 大鼠(雄性)，200 g体重，购于扬州大学比较医学动物中心。

1.2方法

1.2.1复方制备 煎煮生药量为土茯苓1份，鬼箭羽1份，生苡仁1份，徐长卿1份，放入1.5 L煎药罐中，加入1 L水，浸泡1～2 h，于电磁炉上2 000 W档大火煮开，水开后调到500 W继续微微煮沸约1 h，期间用长筷翻药3～5次。煮好以后，用多层纱布过滤出汤液，冷却备用。

1.2.2高尿酸血症大鼠模型造模 Wistar大鼠喂食定制高酵母饲料，同时给予腺嘌呤100 mg/(kg·d)剂量灌胃，早晚各一次。与此同时给予氧嗪酸钾悬液150 mg/(kg·d)剂量皮下注射2次，每次间隔12 h。每日定时尾静脉取血，全自动生化仪检测血尿酸水平，连续3 d维持高水平视为造模成功。

1.2.3分组及给药 确定造模成功后将大鼠分为阴性照组、模型组、给药组和阳性对照组。阴性对照组为正常饲养，未造模的大鼠。模型组为造模成功组同时灌服等体积超纯水组。给药组以10 g/(kg·d)剂量的复方灌胃。模型组以秋水仙碱0.3 mg/(kg·d)剂量灌胃。每日同一时间灌胃，连续灌胃10 d。

1.2.4样品采集及处理 造模成功后连续给药10 d，各组大鼠麻醉，剖杀大鼠，腹主动脉取血，分别装进1.5 ml EP管中和黄头抗凝采血管中。全部采集完后将黄头采血管中的血立即用全自动生化仪进行分析，检测血尿酸水平。取血时立即将1.5 ml EP管中的全血，进行低温离心(3 000 r/min，15 min)提取上层血清冷冻备检。上层血清利用蛋白芯片进行检测相关免疫炎症因子。

1.2.5大鼠肝肾切片HE染色 造模成功后连续给药10 d，各组大鼠麻醉，PBS等渗液灌注10 min，剖开大鼠腹腔，取下大鼠的肝肾，剥离周围的脂肪及膜组织。将大鼠的肝肾浸泡在福尔马林中，1周后取出大鼠肝肾组织石蜡包埋并切片，进行HE染色，晾干切片备检。

2 结果

2.1造模前后大鼠的尿酸水平 连续喂食定制高酵母饲料，同时给予腺嘌呤灌胃和氧嗪酸钾悬液皮下注射连续9 d检测到大鼠的血尿酸水平持续稳定地处于高水平，与正常对照组相比血尿酸水平显著增高(P<0.01)，见图1，结果显示高尿酸血症大鼠模型造模成功。

2.1给药处理后大鼠的血尿酸水平 结果显示经过连续10 d的给药，该中药复方能显著降低模型组大鼠的血尿酸水平，与模型组相比，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。阳性对照组的(秋水仙碱组)大鼠的血尿酸水平也明显降低，与模型组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)，见图2。

2.3给药处理后痛风相关免疫炎症因子变化 造模成功后，不同组分别给予不同的处理，连续处理10 d后，利用蛋白芯片热荧光技术对各组大鼠的血清进行痛风相关免疫炎症因子的检测分析。统计结果显示，与模型组相比，该中药复方能明显降低痛风相关免疫炎症因子(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-13、TNF-α)的水平，对痛风相关的炎症因子具有明显的抑制作用如图3所示，结果说明该中药复方具有明显的炎症抑制作用。

2.4给药处理后大鼠的短期肝肾毒性检测 HE染色后显微镜下观察服药后大鼠的肝肾组织形态，结果发现，给药后大鼠的肝肾组织细胞分布均匀，未见明显的肝肾组织损伤，结果如图4所示。

图1 正常大鼠和模型组大鼠的血尿酸水平Fig.1 Serum uric acid levels in normal and model ratsNote:***.P<0.001 vs Model group.

图2 给药10 d后各组大鼠的血尿酸水平Fig.2 Blood uric acid level of rats in each group after 10 days administrationNote:**.P<0.01，***.P<0.001 vs Model group.

图3 给药10 d后各组大鼠的免疫炎症因子水平Fig.3 Immune-inflammatory factor levels in rats of each group after 10 days administrationNote:*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 vs Model group.

图4 给药10 d后大鼠的肝肾切片HE染色照片Fig.4 HE staining photographs of liver and kidney sections of rats after 10 days administration

3 讨论

本实验研究的复方，是在刘延庆教授长期临床运用中，从大方中精简而来的。经多年临床经验总结和动物实验，证明确实有效的一组最佳药味和配比的精简复方。临床使用经验显示该方能显著缓解患者临床症状，同时降低患者的血尿酸水平，达到标本兼治的效果。这是很多治疗痛风的其他药物所不能达到的，现在临床常用的治疗药物大多是以缓解临床症状为主，可以说是治标不治本。而本研究通过大鼠模型进行体内实验发现，该复方可以明显降低患病大鼠的血尿酸水平，而降低血尿酸水平是治疗痛风和高尿酸血症的根本所在[20]。目前临床上还没有一种特效药可以显著降低血尿酸水平的，该实验研究结果显示了该复方治疗高尿酸血症的良好效果。此外，高尿酸血症会慢慢引起尿酸盐的沉积，而尿酸盐结晶会刺激和激活巨噬细胞引起炎症细胞浸润和炎症因子的分泌，从而导致一系列的炎症反应，进而形成急性关节炎。因此，本课题组同时检测了痛风可能引起临床病理症状的相关免疫炎症因子。结果发现，该复方能够显著降低模型组大鼠血液中IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-13和TNF-α的水平。IFN-γ是机体最重要的免疫效应因子之一，能够增强自然杀伤细胞(NK)活性，有研究发现，类风湿性关节炎患者血清IFN-γ水平显著上调，而抑制IFN-γ可以有效抑制痛风和高尿酸血症引起的炎症反应[21]。而本实验中，该中药复方可以有效降低IFN-γ的水平，抑制炎症反应的发生。IL-1β是经典炎症反应调节剂IL-1 的一种可与IL-2一起可以可诱导基质金属蛋白酶的产生，调节软骨细胞的功能和促进代谢因子的表达，加速软骨基质降解和退化，因此抑制IL-1β和IL-2可以保护痛风引起的骨损伤[22]。而本实验结果显示，该复方可以有效抑制IL-1β和IL-2的表达，从而减缓痛风引起的骨损伤。此外，IL-4 和IL-2都能促使IgE的分泌、活化和聚集从而加重痛风性关节炎的炎症反应[23]。而该中药复方可以显著降低IL-4 和IL-2的表达水平，减轻痛风引起的炎症反应。TNF-α属于前炎症细胞因子，在整个炎症反应过程中发挥重要作用，是患者机体内细胞因子调节网络的启动因子，具有局部促炎性反应作用，刺激中性粒细胞，进而启动炎症反应[24]。另外，IL-13和痛风的相关性研究鲜有报道，IL-13是趋化因子家族的一种细胞因子，介导T细胞和B细胞的活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。而本实验中，该中药复方可以有效降低TNF-α和IL-13的水平，抑制炎症反应的启动过程，从而减少高尿酸血症和痛风引起的临床症状。这些实验结果充分说明该复方能够缓解高尿酸血症和痛风引起的病理性炎症反应，从而改善痛风的临床症状。与此同时本课题组还检测了该复方短期服用对于大鼠肝肾的影响，结果并未发现对大鼠的肝肾有明显的组织损伤，这说明短期内该复方不会对肝肾功能造成影响。

综上所述，该复方既可以从根本上降低血尿酸水平，同时明显抑制痛风引起的免疫炎症反应，改善痛风和高尿酸血症引起的临床症状。不仅如此，短期内服用该复方不会有明显的肝肾毒副作用。这些研究结果为早日寻找和开发效果好并且毒副作用小的抗痛风和高尿酸血症的药物奠定了一定的实验基础。但是其中具体的作用方式及分子机制仍不清楚，有待于进一步研究。