杨 静 马 泉 张 元

(甘肃中医药大学附属医院肺病科，兰州730000)

慢性肺源性心脏病 (Chronic pulmonary heart disease，CPHD )是由支气管、肺组织、胸廓或肺血管病变致肺血管阻力增加，产生肺动脉高压，继而右心室结构或 (和)功能改变的疾病[1]。益气温阳活血利水法是目前公认的治疗CPHD的有效方法之一，其理论依据在于心衰发病病机是气虚血瘀水结而定的[2]。已有文献报道在CPHD患者中采用益气温阳活血利水法可以显著改善患者预后，提高心脏功能[3]。但目前关于益气温阳活血利水法治疗CPHD具体分子机制尚不清楚。有学者指出心力衰竭水潴留机制的主要途径为心输血量下降-血管加压素水平升高-肾脏集合管 V2 受体激活-水通道蛋白(AQP)激活和/或基因表达上调-水重吸收增加[4]。AQPs家族的多个成员在CPHD中均发挥重要作用，如AQP2在调节机体水液代谢中起着重要作用。但是，AQP4在心肌细胞重塑过程中作用仍不清楚，尤其是益气温阳活血利水法是否通过调控AQP4改善心肌细胞重塑目前仍缺乏相关研究[5]。因此，本研究拟通过益气温阳活血利水法干预CPHD大鼠，探讨益气温阳活血利水法对CPHD大鼠心脏功能的改善作用及与AQP4相关具体分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 6～8周SD大鼠48只，由甘肃中医药大学动物中心提供，饲养于SPF级实验室中，充足饮食，室温(18～25)℃，湿度50%～80%，合格证号:SYXK(X) 2018-015；AQP4、pERK1/2、ERK1/2、GAPDH购自Abcam公司；HRP标记羊抗小鼠、HRP标记羊抗兔购自博士德生物科技公司；免疫组化试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；其他实验所需试剂与实验设备由甘肃中医药大学实验中心提供。

1.2方法

1.2.1造模与分组 健康雄性SD大鼠，按无水乙醇与生理盐水(2∶8) 混合液配成1%的MCT溶液，以60 mg/kg腹腔注射，空白组不予注射，21 d后采大鼠颈动脉血检测大鼠二氧化碳分压(PaCO2)、氧分压(PaO2)、动脉血氧饱合度(SaO2)；采用心脏彩超检测心率(HR)，左心室收缩率(LVSP) 、最大左室内压变化速率(LVdp/dtmax)显著下降，提示大鼠CPHD模型建立成功，具体见表1。共45只大鼠，按随机数字表法分为对照组(Con组)、CPHD模型组(CPHD组)、实验组(Exp 组)3组，每组15只。Con组不予注射MCT与药物，余与其他组无差异；CPHD组给予建模；建模成功后给予安慰剂灌胃；Exp 组按成人体重与剂量折算公式，换算成大鼠剂量给予益气温阳活血利水法汤剂灌胃。

1.2.2益气温阳活血利水法汤剂制备 采用具有益气温阳活血利水功效的健心汤灌胃，每日1剂，水煎服，每日2次，疗程为4周，按成人体重与剂量折算公式计算给药量(60 kg/d)，大鼠给药量=(大鼠体重/60 kg)/d。健心汤方剂为：生黄芪30 g 、太子参20 g 、熟附子10 g 、仙茅 10 g 、红花 20 g 、川芎15 g 、葶苈子20 g 、茯苓20 g 、香附10 g 、桂枝10 g。

1.2.3标本采集 于给药后4周，以 10%水合氯醛(350 ml/kg)腹腔注射麻醉动物，开胸，快速取出心脏标本，立即放置于-80℃冰箱冻存备用。

1.2.4Western blot 按不同因素处理细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度，采用5×上样缓冲液稀释，使用12%分离胶电泳，转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST漂洗10 min×3次，用5%TBST稀释的BSA稀释一抗，分别与膜接触4℃孵育过夜后，用TBST漂洗10 min×3次，加二抗室温下孵育1 h 后，用TBST 洗膜10 min×3次，在Gene Gnome曝光仪上曝光并拍照。

1.2.5qRT-PCR 获得样本，严格按照RNAgent Isolation System说明书，抽提总RNA。取1 μg总RNA，严格按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA。PCR反应在PE公司GeneAmp8 5700型PCR扩增仪上进行，严格按照SYBR green说明书加样，总反应体系20 μl，各样本加cDNA 2 μl；SYBR green 10 μl；商品化引物 2 μl (AQP4:MQP046624；GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司，美国)；RANase Rree去离子水 2 μl。按两步法反应94℃ 30 s，58℃ 30 s，反复40个循环以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照进行分析。

2 结果

2.1各组心功能比较建模成功后，CPHD组大鼠 PaCO2、HR显著高于Con组，而CPHD组PaO2、SaO2、LVSP、LVdp/dtmax显著低于Con组，差异具有统计学意义(P<0.05)；另外，Exp 组PaCO2、HR较CPHD组显著下降，而PaO2、SaO2、LVSP、LVdp/dtmax较CPHD组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表 1。

2.2各组心肌细胞AQP4表达比较在mRNA水平，CPHD组AQP4表达显著低于Con组，差异具有统计学意义(P<0.05)；另外，Exp 组AQP4表达较CPHD组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。在蛋白水平己发现与mRNA水平相似的结果，见图 1。

表1 各组心功能比较

Tab.1 Comparison of cardiac function in each group

GroupsPaCO2HRPaO2SaO2LVSPLVdp/dtmaxCon38.67±10.8589.38±21.0687.39±18.2592.36±17.6827.83±3.961092.66±84.89CPHD49.92±11.41117.58±23.4257.53±17.7173.25±16.6421.45±4.02768.42±91.13Exp41.57±10.26104.29±22.3669.38±17.8282.49±15.3724.57±3.28861.59±88.26F3.626.0010.554.9810.7553.82P0.0350.0050.0000.0120.0000.000

图1 各组心肌细胞AQP4表达比较Fig.1 Comparison of AQP4 expression in cardiomyocytes of each groupNote: A.Comparison of AQP4 expression at mRNA level;B，C.Comparison of AQP4 expression at protein level,**.P<0. 01.

表2 各组IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子表达比较

Tab.2 Comparison of IL-1β,IL-6,TNF-α expression in each group

GroupsIL-1βIL-6TNF-αCon24.69±7.8510.38±5.0687.39±21.25CPHD53.71±9.6219.58±3.42117.53±20.71Exp42.85±9.0314.29±5.3696.38±22.84F41.0414.627.68P0.0000.0000.001

图2 Western blot检测各组ERK、NF-κB表达Fig.2 Expression of ERK,NF-κB in each group detected by Western blotNote: A，B.Protein level of pERK1/2 and pNF-κB;C.Expression of pERK1/2 and pNF-κB.**.P<0.01.

2.3各组IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子表达比较在mRNA水平，CPHD组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著高于Con组，差异具有统计学意义(P<0.05)；另外，Exp 组IL-1β、IL-6、TNF-α表达较CPHD组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表 2。

2.4各组ERK、NF-κB表达比较在蛋白水平，CPHD组pERK1/2、pNF-κB表达显著高于Con组，差异具有统计学意义(P<0.05)；另外，Exp 组pERK1/2、pNF-κB表达较CPHD组显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图 2。

3 讨论

CPHD 属中医“咳嗽”、“痰饮”、“ 心悸”、“ 喘证”、“肺胀”等范畴，痰瘀互阻是CPHD主要病机特点，且贯穿其始终[3]。CPHD病理性质为脾肾阳虚为本，痰浊、水饮、瘀血为标的本虚标实。CPHD首先为肺胀，病变在肺，多属积渐而成，病程缠绵，迁延不愈，导致肺气胀满，不能敛降，日久伤及脾肾。心脉上通与肺，肺气辅佐心脏治理，调节心血的运行，心阳根于命门真火，故肺肾阳虚，均可病及于心，心气无力推动血脉，则血行涩滞，可见唇、舌、甲紫绀等淤血之表现。益气温阳活血利水法具有益气通络，活血化瘀之功效，我们的临床研究与前期文献报道己证明，益气温阳活血利水法治疗CHPD疗效显著，能显著改善患者症状与预后。从中医理论上讲，附子、干姜属辛热之品，可温肾阳补脾阳，使肾阳得复、气化得行，温肺化饮。白术性甘苦而温，燥湿健脾；附子振肾阳于先，姜、术复脾阳于后；川芎为“血中之气药”，气行则血行，则瘀血自除。茯苓、猪苓、泽泻健脾利湿，淡渗利水，使水气从小便而出；丹参、赤芍助川芎活血化瘀。葶苈子泻肺平喘利水，具有显著的止咳平喘强心利尿，抗感染作用。方剂中采用上述药物配伍合用，全方辨病与辨证相结合，标本兼顾，配伍严谨，针对性强共奏温阳化瘀利水之功[6-9]。我们在大鼠CHPD模型中进一步证实，益气温阳活血利水法能显著改善大鼠的生化指标，改善肺部氧和情况，提高心脏功能。

但是，目前益气温阳活血利水法治疗CHPD的具体分子机制尚不清楚。有研究认为当归可通过降低血小板聚集和抗血栓作用，扩张肺动脉发挥保护心脏作用；黄芪、茯苓可通过增强机体免疫，改善免疫状态；但是其对于心肌细胞的作用仍缺乏相关研究[10]。AQP4 是AQP家族的重要成员，在细胞膜中以四聚体形式存在，生理情况下，水通过细胞膜包括磷脂双层的简单扩散和通过AQP实现跨膜转运两个过程[11]。研究表明，AQP表达与心肌细胞耐受缺血能力密切相关，缺血心肌细胞AQP表达明显下调[12]。同时，中医理论认为痰湿是水液代谢失调的产物，与水通道蛋白关系密切[13]。因此，我们探究了益气温阳活血利水法对CHPD大鼠心肌细胞AQP4表达的调控作用，发现CHPD大鼠心肌细胞AQP4表达明显减少，给予益气温阳活血利水法治疗后显著升高，这一可能是该方剂治疗CHPD的重要分子机制之一。

另外，越来越多证据表明机体免疫失调与CHPD的发生发展密切相关，是CHPD发生发展的重要病理生理机制之一[14]。炎症因子可通过介导肺毛细血管收缩以及通透性改变，肺纤毛细胞损伤等多种机制介导肺损伤，同时还能通过调控心室重构、降低心肌收缩力等作用诱发加重心衰[15]。同时，研究认为炎症因子与AQP的表达密切相关，尤其是IL-6、TNF-α在调节AQP的表达中发挥重要作用，介导AQP表达的下调。IL-6、TNF-α等被认为是心脏的“自杀行为”因子，尤其是IL-6在心脏细胞因子分泌中发挥核心作用，诱生TNF-α等多种炎症因子[16]。通过我们的研究证实，CHPD大鼠心肌中IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高，给予益气温阳活血利水法治疗后可显著降低。

进一步探究与IL-1β、IL-6、TNF-α合成分泌相关的ERK、NF-κB信号通路，在给予益气温阳活血利水法治疗后的变化发现，在给予益气温阳活血利水法治疗后，ERK、NF-κB信号通路的激活显著下降。当心脏受到外源性损伤后，多种损伤相关分子通过激活心肌细胞表面的如TLRs、NOD等受体，进一步激活下游的ERK1/2信号途径，从而激活核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)启动转录，使心肌细胞合成释放炎症因子与炎症趋化因子[17]。目前，关于益气温阳活血利水法的具体影响信号通路的研究尚较缺乏，而针对ERK1/2的研究较少。有学者报道在抑制ERK1/2的表达，并可发挥心肌细胞保护作用，但目前针对AQP4表达下调的机制仍缺乏[18]。通过我们的研究推测，益气温阳活血利水法可以通过抑制ERK、NF-κB信号通路，减少IL-1β、IL-6、TNF-α的合成，从而促进AQP4的表达上调，发挥心肌保护作用。

综上所述，益气温阳活血利水法通过抑制ERK、NF-κB信号通路，抑制炎症反应，上调心肌细胞AQP4表达，改善CHPD大鼠心脏功能与血液氧化情况，这可能是益气温阳活血利水法治疗CHPD的重要分子机制。