殷 皓 周卫东 韩菲菲 俞 蕾 费 捷 崔玉宝

(南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科，无锡214023)

嗜酸性粒细胞(Eosinophils，EOS)浸润是支气管哮喘的主要病理特征之一。活化的嗜酸性粒细胞释放嗜酸性粒细胞源性神经毒素(Eosinophil derived neurotoxin，EDN)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(Eosinophil cationic protein，ECP)、主要碱性蛋白(Major basic protein，MBP)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(Eosinophil peroxidase,EPO)，参与支气管收缩、上皮损伤与气道高反应性[1]。动物试验发现MBP和ECP对气道上皮细胞具有细胞毒性，EDN与ECP一样具有神经毒性[2]。文献报道支气管哮喘患者血清ECP水平显著升高，其与哮喘病情程度具有一定相关性，但是其与患者肺功能和支气管高反应性的相关性仍有争议[3]。

迄今，儿童哮喘诊断、病情程度评价、治疗过程仍缺乏客观的实验室指标[4]。EDN是一种新型的过敏反应标志物，本研究针对EDN诊断儿童呼吸道过敏反应性疾病的价值及其与血清IgE(tIgE)的相关性进行了研究，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 以2017年3月～2018年3月在我院就诊、符合本研究纳入标准过敏性哮喘或/和过敏性鼻炎的65例患儿作为病例组，22例健康儿童为对照组，两组研究对象的监护人均对本研究知情并签署知情同意书，本研究方案经医院医学伦理委员会审核通过(伦理审查号：KYLLH2018034)。

1.1.2诊断标准 过敏性鼻炎诊断参考中华医学会耳鼻咽喉科学分会制订的《变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年，天津)》[5]，过敏性哮喘诊断参考中华医学会儿科学分会呼吸学组制订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[6]。病例组患儿的血清tIgE水平均>100 kU/L。

1.1.3排除标准 合并有恶性肿瘤、血液疾病、自身免疫疾病、肝肾功能不全的患者；长期应用免疫抑制剂或糖皮质激素的患者。

1.2方法 所有受试者均于清晨空腹采集外周静脉血，于4℃下静置2 h后以3 000 r/min的速度离心15 min，取血清检测tIgE、EDN、嗜酸粒细胞阳离子蛋白(Eosinophil cationic protein,ECP)、血清高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein,HMGB1)。血清总IgE和过敏原特异性IgE检测采用免疫印迹法，试剂盒为AllergyScreen Test Kit，生产企业为德国Mediwiss Analytic GmbH。EDN检测采用ELISA方法，试剂盒由MBL(Nagoya,Japan)公司生产(Code No.7630)。ECP检测采用 ELISA方法，试剂盒由ImmunoWay Biotechnology Company(TX,USA)公司生产(Code No.KE1709)。HMGB1采用ELISA方法，试剂盒由arigo Biolaboratories (Taiwan)公司生产(Code No.ARG81351)。检测过程均严格按照试剂盒使用说明书进行操作。

2 结果

2.1一般资料 病例组和对照组的年龄、性别构成、肺功能指标等方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，具体见表1。

2.2血清tIgE、EDN、ECP、HMGB1水平检测结果 根据血清tIgE水平将病例组分为A组(血清tIgE水平>200 kU/L)和B组(血清tIgE水平为100～200 kU/L)，比较A、B组和对照组血清ECP、EDN、HMGB1水平，结果显示三组患儿的血清ECP水平的差异无统计学意义(P>0.05)，血清EDN和HMGB1水平的差异均有统计学意义(P<0.05)。尽管A、B组患儿血清EDN和HMGB1水平的差异无统计学意义(P>0.05)，但均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 两组患者临床资料的比较

Tab.1 Comparison of clinical data between case and control groups

Clinical dataCase group(n=65)Control group(n=22)t value/χ2 valueP valueAges (yrs)4.62±1.744.14±2.460.8460.405Gender(male/female)42/2311/221.4750.225FEV1(%,pred)82.65±12.2683.48±14.050.2640.897FEV1/FVC(%)75.56±3.7576.26±3.810.7540.568

Index Group A(n=42)Group B(n=23)Control group(n=22)F valuesP valuestIgE(kU/L)280.20±56.792)3)150.58±28.471)3)51.31±29.031)2)200.393<0.001ECP(pg/ml)1 862.74±387.89 1 860.00±381.95 1 911.93±496.89 0.1200.887EDN(ng/ml)251.75±116.753) 237.90±97.563) 94.84±57.651)2)19.177<0.001HMGB1(ng/ml)0.24±0.293) 0.38±0.383) 0.14±0.241)2)3.5620.033

Note：1)vs Group A，P<0.05；2)vs Group B，P<0.05；3)vs Control group，P<0.05.

表3 血清EDN、ECP、HMGB1水平对儿童呼吸道过敏性疾病的诊断价值分析

Tab.3 Diagnostic values of sera EDN,ECP and HMGB1 in respiratory allergic diseases

IndexAUCStandard errorP values95%CI of AUCLowUpperECP0.4900.0780.8840.3360.643EDN0.8940.0380.0000.8200.967HMGB10.6300.0640.0690.5050.755

图1 血清EDN、ECP、HMGB1水平诊断儿童呼吸道过敏性疾病的ROC曲线Fig.1 ROC curves of EDN,ECP and HMGB1 in diagnosis of children with respiratory allergic diseases

2.3血清EDN、ECP、HMGB1水平诊断儿童呼吸道过敏反应性疾病的价值分析 ROC曲线分析结果显示，血清EDN水平诊断儿童呼吸道过敏反应性疾病的AUC具有统计学意义(P<0.05)，AUC值为0.894，而血清ECP、HMBG1水平诊断儿童呼吸道过敏性疾病的AUC无统计学意义(P>0.05)，具体见表3和图1。

2.4患儿血清EDN、ECP、HMGB1水平与tIgE水平的相关性 剔除对照组后，以病例组患儿血清tIgE水平为因变量， 以血清EDN、ECP、HMGB1为自变量，进行相关性分析，直线相关分析结果显示，患儿血清EDN水平与血清tIgE水平具有相关性(P<0.05)，见表4和图2。多元线性回归分析结果显示，患儿血清EDN水平与血清sIgE水平具有相关性(P<0.05)，见表5。

表4 患儿血清EDN、ECP、HMGB1水平与sIgE水平的直线相关分析

Tab.4 Linear correlation analysis between levels of EDN,ECP and HMGB1 and sIgE

Index r valuesP valuesECP0.0410.703EDN0.405<0.001HMGB10.1030.340

图2 呼吸道过敏性疾病患儿血清EDN、ECP、HMGB1水平与sIgE水平的相关性Fig.2 Linear correlation analysis between levels of EDN,ECP and HMGB1 and sIgE

表5 患儿血清EDN、ECP、HMGB1水平与tIgE水平的多元线性回归分析

Tab.5 Multivariate linear regression analysis of levels of EDN,ECP and HMGB1 and sIgE

Variable Uncalibrated regression coefficientβStandard errorStandardized regression coefficient Betat valuesP valuesβ (95% CI)LowUpperConstant 145.81552.106-2.7980.00642.177249.452ECP-0.0170.026-0.068-0.6760.501-0.0690.034EDN0.3780.0950.4243.975<0.0010.1890.567HMGB1-14.92936.047-0.044-0.4140.680-86.62556.766

Note："-".no data.

3 讨论

IgE是介导Ⅰ型变态反应的抗体，因此检测血清IgE对Ⅰ型变态反应的诊断和过敏原的确定很有价值[7]。总IgE(total IgE,tIgE)检测是判定机体过敏体质的一种检测手段，是过敏的一个重要标志。当tIgE增高，又没有寄生虫感染，表明患者正处于过敏状态。正常情况下血清IgE的水平很低，用常规测定IgG或IgM的凝胶扩散法检测不出IgE，必须用高度敏感的放射免疫测定法、酶联免疫测定法及间接血凝试验进行检测。本研究采用德国敏筛过敏原定量检测系统，原理为免疫印迹法，结果发现EDN与tIgE水平具有相关性，认为EDN在儿童呼吸道过敏性疾病诊断具有一定的价值。

嗜酸粒细胞在过敏性疾病的病理过程中发挥着重要的作用，可分泌ECP、MBP、EDN、EPO、嗜酸粒细胞蛋白X(EPX)等强碱性蛋白，这些蛋白均被视为嗜酸粒细胞活化和转归的生物学标志物[8]。相关研究已证实了ECP与变应性鼻炎及气道高反应疾病的发病、进展及治疗疗效具有显著的相关性[9]，发作期过敏性哮喘患儿的总IgE水平与ECP水平存在正相关关系，能反映过敏性哮喘患者的气道炎症程度和嗜酸细胞的免疫功能状态。但是支气管哮喘急性发作患者中过敏原的阳性种类数与ECP无显著关联，说明ECP不能反映患者的总体过敏状态[10]。本次研究结果，血清ECP水平与tIgE水平不具有相关性。

HMGB1是一类具有较强促炎效用的核内非组蛋白。在本研究结果中，呼吸道过敏性疾病患儿虽然也出现了血清HMGB1水平的升高，但其水平与sIgE水平无相关性，因此HMGB1诊断呼吸道过敏性疾病中的价值有待进一步研究。笔者认为，原因可能在于两方面，第一，呼吸道过敏性疾病的变态反应主要发生于呼吸道局部，可能对于血清HMGB1水平的影响较小。第二，血清HMGB1水平可能只是随全身炎症反应的产生和加剧而产生变化，但与过敏性疾病的发生无相关性。在进一步的研究中，应对不同病因患儿的呼吸道局部分泌物中的HMGB1表达水平进行检测和比较，以探讨HMGB1与过敏性疾病的相关关系。

EDN是与ECP同类的由嗜酸性粒细胞分泌的特异性蛋白。本次研究结果证实了ECP和EDN均可反映哮喘症状严重程度，但EDN在评价过敏性疾病程度和临床诊断中的敏感度要优于ECP。有文献报道，哮喘患儿血清EDN水平与哮喘症状严重程度呈正相关关系，可将其用于哮喘患者的早期诊断、治疗和病情监测，对那些年龄太小、不能进行肺功能测试的哮喘患儿更加适用[11]。而针对成年哮喘患者的研究结果显示，虽然患者的血清EDN水平与肺功能及症状积分之间缺乏相关关系，但血清EDN水平与尘螨sIgE抗体阳性患者的1秒用力呼气量呈负相关关系，而在尘螨sIgE抗体阴性患者中则无此相关性，在接受治疗后，血清EDN水平从基线的下降幅度与肺功能改善之间具有相关性，这提示了血清EDN水平也可作为监测尘螨sIgE抗体阳性成年哮喘患者的持续气流受限的重要指标[12]。总之，作为一种新型过敏反应标志物，EDN具有优于ECP等指标的优势，但相关研究仍处于起步阶段，许多相关问题还需要进一步的研究予以讨论和证实。

综上所述，相对于ECP和HMBG1，血清END对儿童呼吸道尘螨过敏性疾病的价值更高，其表达水平与螨虫sIgE水平具有显著相关性，能够在一定程度上反映机体的过敏反应程度，有望作为儿童呼吸道过敏反应性疾病的辅助诊断和病情评价的新型生物学指标。