周星丞 张 帆③ 严 瑞 潘秀超 余 洁 潘洪奖 田平平 刘忠强 石明隽 郭 兵⑤

(贵州医科大学病理生理学教研室,贵阳550025)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种发病机制复杂的自身免疫性疾病，以自身大量抗体形成、免疫复合物堆积、补体激活等表现为特征，常累及全身各组织和器官，其中以肾脏受累最为常见[1]。狼疮肾炎(Lupus nephritis，LN) 是SLE最常见的并发症，SLE患者临床上约50%有肾脏受累表现，而肾活检检测肾脏受累几乎为100%，是SLE 患者主要死亡原因之一[2]。LN的发病机制目前尚未十分明确，但公认其是一种免疫复合物介导性肾炎，以肾小球、肾小管、肾血管损伤为主要特征，最终发展至肾纤维化[3]。与其他原发肾脏疾病相同，肾固有细胞及炎症浸润细胞等向肌成纤维细胞转分化也是LN所致肾纤维化的共同途径，其炎症的严重程度与SLE的预后有关，约有20%患者最终进展至终末期肾功能衰竭[4-7]。

血清淀粉样蛋白A1(Serum amyloid A1,SAA1)，是急性时相反应蛋白中重要的一种，当机体存在炎症时，血清中的SAA1水平升高，可被用作炎症反应的标志[8]。研究发现，SAA1水平的改变与很多的病理状态有关，尤其是慢性炎性疾病，如继发性淀粉样变性、动脉粥样硬化，这些原本不表达SAA1的细胞也开始表达SAA1[9，10]。作为一种急性时相反应蛋白，SAA1已应用于临床动脉硬化、肿瘤及急慢性炎症类疾病的诊断[11]。但SAA1在狼疮肾炎及其相关的肾脏纤维化中的作用却鲜有报道。鉴于SAA1与炎症的关系，我们认为验证其在狼疮肾炎组织中的表达以及探索其对于诱导的脏器纤维化的作用就显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与细胞 实验所用自发性狼疮肾炎小鼠MRL/MpJ-Faslpr小鼠(简称LN小鼠)与C57/BL小鼠(用于动物实验阴性对照)购于美国Jackson Laboratory。SPF级屏障环境中饲养，温度控制在(22±2)℃，相对湿度50%～60%，自由饮食，光照周期为日夜各12 h。 LN小鼠于6周龄开始以Dipstick法检测尿蛋白，每周一次。代谢笼收集6、12、18周龄小鼠尿液，测定尿白蛋白/肌酐。正常小鼠肾小管上皮细胞(mouse renal tubular epithelial cells,mRTEC)购自广州 Jennio Biotech Co,Ltd，DMEM低糖型培养基置于细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.1.2主要仪器与试剂 超低温冰箱(Sanyo)；高速低温离心机(Beckman)；Bayer1650全自动生化分析仪(Beckman)；电泳系统及电转移装置(Amersh-am)；凝胶成像系统(Bio-Rad)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；DP72 显微镜(Olypums)；两步法免疫组化检测试剂、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG和DAB显色试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司)；F-12培养基(Hyclone)；胰蛋白酶(Biological Industries)；BCA(Bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒，ECL 显色剂(北京碧云天生物研究所)；蛋白质 Marker 和总RNA 提取试剂盒(北京天根公司);Real-time PCR试剂(广州锐博生物公司);β-tublin抗体、fibronectin(FN)抗体、alpha smooth muscle actin(α-SMA)抗体、E-cadherin(E-ca)抗体、SAA1抗体(Proteintech公司);Masson三色染色试剂盒(Solario公司)；Si-SAA1购自genepharma公司。

1.2方法

1.2.1Masson染色与免疫组织化学 Masson染色参照文献[12]，具体为：石蜡切片常规脱蜡至水，用配置好的Weigert铁苏木素染色8 min，酸性乙醇分化液分化10 s，水洗3次，Masson蓝化液返蓝3 min，蒸馏水洗1 min，丽春品红染色液染色5 min，弱酸工作液洗1 min，磷钼酸溶液1.5 min，弱酸工作液洗1 min，直接放入苯胺蓝染色液中染色1 min，弱酸工作液洗1 min，95%乙醇迅速脱水，无水乙醇脱水3次，每次15 s，二甲苯透明3次，每次2 min，中性树脂封固。免疫组织化学步骤参照文献[13]：具体方法为：取新鲜肾组织用福尔马林固定，进行石蜡包埋、切片(约为0.2 μm)、贴片、按浓度梯度进行脱蜡水化，置于0.01 mol/L柠檬酸盐修复液中进行抗原修复(高压修复)5 min，滴加内源性过氧化物酶阻断剂(3%过氧化氢)室温孵育15 min，PBS洗3遍，一抗孵育过夜，二抗孵育室温1 h，PBS洗3遍，滴加DAB显色剂(1∶20比例)于显微镜下观察，洗净后放入苏木素复染细胞核2 min，5%盐酸乙醇分化5 s，自来水内返蓝15 min，按照由低到高的乙醇梯度进行脱水，置于二甲苯内透明2次，各2 min，风干后中性树脂封片，显微镜下观察。

1.2.2Real-time PCR 检测目标mRNA的表达:按天根公司试剂盒说明书，用 Trizol 法提取各组小鼠肾组织的总 RNA;以 20 μl 反应体系反转录-聚合酶链反应合成 cDNA，应用引物软件设计SAA1 qPCR引物(表1)，由Invitrogen公司合成，Bio-Rad CFX 96TM 荧光定量PCR分析系统行 RT-qPCR。

1.2.3免疫蛋白印迹法(Western blot)检测肾脏组织中的蛋白表达 Western blot方法参照文献[13]，>具体步骤为：提取新鲜小鼠肾脏的全蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜，封闭液(0.1%缓血酸铵缓冲液配制0.5%的脱脂牛奶)室温封闭1 h，加特异性抗体4℃，0.1%缓血酸铵缓冲液洗膜3次后加辣根过氧化物标记的IgG室温孵育1 h，洗膜3次后，化学发光凝胶成像仪自动曝光显影后使用Image Lab软件分析灰度，结果以目的蛋白/β-tublin灰度值比值表示蛋白质的相对表达水平。

表1 qRT-PCR 引物序列

Tab.1 qRT-PCR primer sequences

Sense(5′-3′)Antisense(5′-3′)Negative controlUUCUCCGAACGUGUCACGUTTCCAGAGAUUCUUUGCCCAUTTSAA1-homo-472ACGUGACACGUUCGGAGAATTAUGGCCAAAGAAUCUCUGGTT

1.2.4细胞转染 选定用于转染的mRTEC细胞株，转染前将细胞按(0.5～1)×106个/孔接种于6孔板中，铺板12～24 h，待细胞融合约70%～80%时进行转染，吸去旧的培养基，PBS清洗，每孔加入1.5 ml新培养基。配置A、B液：A液：250 μl空培+2.5 μl siRNA；B液：250 μl空培+5 μl PEI，混匀，室温放置5 min，然后将A、B液混合并混匀，室温孵育20 min，混合液加入6孔板中，十字晃动轻轻混匀，37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育4～6 h，之后吸去转染复合物的培养基，更换新鲜完全培养基。转染24～36 h后，收集细胞，提取细胞RNA进行荧光定量PCR和Western blot检测，验证干扰效率。

1.2.5免疫荧光共聚焦 细胞长至合适浓度，计数后调整浓度为2×104个/ml，接种于激光共聚焦小皿，长至50%进行实验。吸净培养基，无血清培养基洗一遍，加入LPS刺激，37℃处理(分组如下)细胞分为4组：第一组NC组，无特殊处理；第二组：LPS(10 μg/ml，24 h)组；第三组：LPS+Si-NC;第四组：LPS+Si-SAA1。 处理好后加入预冷 PBS洗3遍,4%多聚甲醛常温固定 30 min,PBS 洗3遍,1%Triton 室温破膜 15 min,PBS 洗3遍,3% BSA常温封闭30 min,孵育一抗,4℃过夜,PBS洗3遍,荧光二抗室温孵育2 h,滴加 DAPI 染核 5 min,PBS 洗3遍,荧光显微镜观察。

图1 LN小鼠肾脏纤维化情况Fig.1 Kidney fibrosis in LN miceNote: Masson staining indicate，compared with the normal group,the LN group had more staining and the fibrosis level was significantly higher.

2 结果

2.1小鼠肾脏组织镜下结果分析 Masson染色结果显示，与正常小鼠阴性对照(NC)组相比，LN组小鼠肾组织可见肾小管腔部分有扩张，肾小管排列不规则，上皮细胞发生玻璃样变性，呈空泡状，且LN组胶原表达明显升高(见图1)；免疫组化结果显示，与正常小鼠阴性对照(NC)组相比，LN组小鼠的SAA1及α-SMA蛋白表达明显升高，而E-Ca表达减少(见图2、3)。

2.2小鼠肾组织中SAA1的mRNA与蛋白表达水平 荧光定量PCR结果显示：与NC组相比，LN组小鼠肾组织 SAA1 mRNA 表达显著上调(P<0.05)，(见图4)；同时Western blot结果也显示LN小鼠肾脏中SAA1的蛋白水平升高(P<0.05，见图4、5)。

2.3沉默SAA1对LPS刺激下小鼠肾小管上皮细胞EMT的影响 细胞转染后一共分为四组：LPS空白对照组为1组；LPS(10 μg/ml)处理组为2组；LPS(10 μg/ml)+Si-NC为3组；LPS(10 μg/ml)+Si-SAA1为4组。24 h后收集细胞，提取蛋白，应用Western blot方法检测细胞内SAA1、α-SMA、E-Ca和FN蛋白水平。结果显示：相对于1组、2组中细胞的SAA1、α-SMA和FN蛋白水平明显高升高，而E-Ca水平明显下降(P<0.05)；相对于3组，第4组细胞中的SAA1、α-SMA、FN蛋白水平明显下降，而E-Ca表达上升(P<0.05)(见图6)；同时免疫荧光共聚焦的结果，均支持以上Western blot结果(P<0.05)(见图7)。

图2 免疫组化检测SAA1表达Fig.2 Detection of SAA1 expression by IHCNote: The level of SAA1 in the LN group was significantly increased in LN mice.

图3 免疫组化检测α-SMA及E-Ca表达Fig.3 Detection of α-SMA and E-Ca expression by IHCNote: Compared with the normal group,the expression of α-SMA was increased and the expression of E-Ca was decreased in the LN group.

图4 LN小鼠肾脏中SAA1 mRNA的表达Fig.4 Expression of SAA1 mRNA in kidney of LN miceNote: Compared with the NC group，*.P<0.05.

图5 Western blot检测SAA1在肾组织中的表达Fig.5 Expression of SAA1 protein in kidney by Western blotNote: Compared with the NC group，*.P<0.05 .

图6 SAA1对肾脏纤维化的影响Fig.6 Effect of SAA1 on renal fibrosisNote: After LPS stimulation,the expression of α-SMA and FN in mRTECs was significantly increased,and the level of E-Ca was decreased.After Si-SAA1 was added,the above situation was offs.

图7 免疫荧光检测α-SMA和FN的表达Fig.7 Immunofluorescence detection of α-SMA and FN expressionNote: After LPS stimulation,the brightness of α-SMA and FN increased; adding Si-SAA1,the brightness was weakened.

3 讨论

LN是SLE的主要并发症之一，其主要临床表现为蛋白尿、血尿，在肾脏损害累及肾脏的各个部分，包括肾小球、肾小管、间质及血管[5，14]。有文献报道，LN肾小管间质损伤的发生率可高达51%，肾小管间质损伤不仅仅是肾小球病变的伴随表现，也有可能是LN独立的、重要的参与者，且可影响患者的预后[15]。另有研究显示，LN肾小管间质损伤能诱导肾小管上皮细胞间充质转分化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促进肾脏纤维化的发生，进而导致终末期肾病，引起肾衰竭[16]。EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，常具有E-Ca蛋白表达的减少、α-SMA和FN蛋白增多等特征[17]。因此本文对这些指标进行检测就是为了反映相关细胞的EMT进程。

本实验Masson染色的结果中，NC组小鼠肾小管轮廓清晰，各部分结构无明显异常；而LN组小鼠的肾组织中可见明显的炎症与纤维化病变，且有大量胶原沉积，由此推测SLE狼疮肾炎小鼠模型是成功的。免疫组化EMT相关指标的结果也进一步验证了模型的可靠性。

SAA是由多基因家族编码的蛋白质，进化上高度保守。在小鼠中，SAA家族的所有四个基因SAA1、SAA2、SAA3、SAA4都聚集在7号染色体上，并主要在肝脏中表达[18,19]。但近年来相关研究发现SAA蛋白在小鼠肝外组织中也有表达，主要为上皮细胞和巨噬细胞；此外，人们发现在肿瘤细胞、淋巴细胞、上皮细胞及类风湿关节炎患者的滑膜细胞中均发现SAA蛋白或mRNA的表达[20]。在大量引起全身急性炎症反应的疾病发病过程中，此类细胞作为SAA蛋白表达的潜在来源，在局部疾病的发生发展中起着重要作用，甚至成为影响疾病预后的关键环节，因此探寻SAA的这些局部作用必将为某些疾病防治提供有效靶点。SAA1作为血清淀粉样蛋白A家族的最主要组成成分，是家族中表达最广泛、活性最强、反应最敏感的亚型[21]。在各种疾病如外伤、肿瘤、感染及炎症发病过程中升高可达到数千倍以上[22]。相关研究表明，SAA在脏器纤维化病变的发生发展中也发挥着重要作用，Piotti等[23]发现SAA在早期脏器纤维化中表达明显增加。本文在小鼠肾脏切片中检测，相对于正常组而言，狼疮肾炎小鼠SAA1表达明显升高，提示其可能与肾脏纤维化的发生过程相关，组织的mRNA和蛋白水平检测也发现SAA1的表达有明显升高，与本次实验预期结果一致。

在体外实验中，大量相关研究均利用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激细胞模拟LN细胞环境[24]，并且考虑其与炎症的相关性，因此本实验利用LPS体外处理小鼠肾小管上皮细胞模拟狼疮肾炎的炎症反应，运用Westren blot和免疫荧光共聚焦观察EMT相关蛋白E-Ca、α-SMA及FN的变化，经LPS刺激后，α-SMA及FN表达明显升高，E-Ca表达明显下调；沉默SAA1后能有效抑制LPS促进EMT的作用，这说明SAA1参与肾脏纤维化疾病过程，且在其中扮演着促纤维化角色，与动物实验结果一致。至此，我们认为急性炎症反应能够刺激SAA1的迅速大量生成，趋化炎性细胞浸润，激活下游通路促进肾小管上皮细胞EMT的发生，从而促进肾脏纤维化的发生发展。同时，进一步验证SAA1诱导小鼠肾小管上皮细胞EMT进程的分子机制以及探讨SAA1的上游转录因子对其在LN肾脏组织中异常表达的诱导机制是接下来的研究方向，以期未来能研发相关药物及为临床提供有效治疗靶点。