邹云莲 胡 边 张李琛 张进萍 朱学锴 黄行许 严新民

(昆明理工大学医学院，昆明650500)

细胞因子是调控机体免疫反应的重要因子。以细胞因子为基础的肿瘤治疗一直是人们关注的焦点。IL-12，由于其在诱导机体抗肿瘤免疫方面发挥的重要作用，成为科研工作者临床转化研究的重点研究对象[1,2]。

IL-12是由树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及人类B淋巴母细胞等细胞受相应抗原刺激后产生，是刺激T细胞生长，促进CD8细胞记忆性，诱导CD4辅助细胞向Th1细胞转化的重要介质，这是其发挥抗肿瘤机制的重要基础。此外，IL-12可通过诱导γ干扰素和肿瘤坏死因子-α的产生，降低IL-4对IFN-γ的抑制，负性调节IL-10,转化生长因子β1，从而促进免疫细胞肿瘤浸润，改善免疫抑制微环境[3,4]。然而，大量临床所研究显示大剂量IL-12蛋白的直接输注给机体带来的毒副作用严重限制其在临床的应用。因此，如何安全有效地向机体导入IL-12使其扬长避短发挥抗肿瘤效应是使IL-12走向临床所面临的迫切问题[5,6]。本研究利用基因工程手段体外构建人IL-12载体，通过非病毒转座子系统将其导入T细胞中获得稳定表达，初步探讨该方法的可行性。

1 材料与方法

1.1材料 实验用的PiggyBac转座子系统由上海科技大学生命科学与技术学院朱学锴博士提供；人IL-12 cDNA免费索取于厦门大学韩家淮实验室；高保真PCR扩增酶及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；内切酶SpeⅠ和SalⅠ购自NBE公司；胶回收试剂盒及无内毒素质粒大抽试剂盒购自北京天根生物技术公司；分离PBMC所用的全血来自云南省第一人民医院；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；IL-12 ELISA试剂盒,流式检测用抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC及同型对照购自Ebioscience公司；电转试剂Amaxa Human T cells Nucleofector Kit 试剂盒购自lonza公司；细胞因子IL-2，单抗CD3、CD28均购自北京同立海源生物有限公司；过表达luciferin的神经胶质瘤细胞U251-Luc由上海科技大学黄行许教授惠赠。

1.2方法

1.2.1IL-12过表达载体的构建 人IL-12是由重链p40和轻链p35构成的双链结构，两条链通过二硫键共价连接形成功能蛋白发挥生理作用。为了构建具有生理功能性IL-12，我们按照图1的设计思路进行载体构建。首先，从厦门大学韩家淮实验室免费索取人IL-12基因克隆,利用高保真扩增酶通过表1引物扩增出p35和p40基因片段。在引物的设计过程中，考虑到载体多克隆位点，在引物两端引入相应的酶切位点。同时，为了构建具有功能的IL-12融合蛋白，我们选用目前最为常用的Huston设计的(GlySer)3作为p40与p35基因间的Linker。因此在引物设计时，我们在p40下游引物3′端加入Linker部分N端序列，在p35上游引物的5′端引入Linker的C端序列，并保证两条引物的Linker有15个碱基的重叠，使后续PCR扩增中形成p40与p35连接的稳定接头。

图1 IL-12过表达载体的设计Fig.1 Vector design carrying human IL-12 gene

1.2.2IL-12与PiggyBac转座子系统连接的克隆形成 我们将IL-12基因片段与PiggyBac表达载体同时用SpeⅠ和SalⅠ酶37℃水浴中双酶切，回收载体片段和IL-12酶切片段，T4 DNA连接酶16℃连接过夜后取2 μl连接产物进行转化，涂Amp+抗性LB平板，37℃恒温箱中过夜生长。

1.2.3IL-12阳性克隆的鉴定 次日挑取生长的克隆于20 μl灭菌ddH2O充分振荡混匀，取1 μl菌液用表1的IL-12B-FWD1和IL-12A-REV引物进行扩增，电泳检测扩增结果。随意挑取2个阳性扩增的克隆摇菌过夜，小提质粒后测序进一步验证。

1.2.4人外周血PBMC的分离 人的原代T细胞从新鲜全血中分离得到。全血来自云南省第一人民医院的健康献血者。使用淋巴细胞分离液从新鲜的全血或白膜中分离得到外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。新鲜分离的PBMC用无血清RPMI1640培养液(Gibco)按1×107ml-1细胞密度重悬接种于6孔板后于37℃细胞培养箱中贴板2 h。取出6孔板，轻吹细胞，收取未贴壁细胞(未贴壁的细胞是淋巴细胞，包含B和T细胞；贴壁的细胞有单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等)于离心管中以800 r/min离心5 min，弃培养液，无血清RPMI1640培养基重悬细胞后计数，用于后续电转。

1.2.5PBMC的电转及T细胞的体外扩增 配制电转体系，分别为:①对照组：PiggyBac空载体和转座子酶载体(两者的量分别为10 μg 和5 μg)；②IL-12过表达组： PB-IL-12过表达载体和转座子酶载体(两者的量分别为10 μg和5 μg)，两个电转体系中都加入0.5 μg pEGFP-N2质粒作为电转效率初步判断指标。具体步骤为：按maxa Human T cells Nucl-eofector Kit 试剂盒要求配制电转液并与(1.5～2)×107淋巴细胞充分混匀，在混合液中加入对应质粒，充分混合后轻柔加入电极杯，避免气泡产生，使用Lonza Nucleo-fector 2B电转仪U-014程序电转。电转12 h后流式检测转染效率。收集细胞，离心并计数，以1×106ml-1细胞密度培养，培养液中加入100 U/ml 的IL-2，CD3和CD28单抗各200 ng/ml刺激细胞生长3 d改用300 U/ml的IL-2维持培养至14 d。

表1 IL-12载体构建中的引物序列

Tab.1 Primers used for construction of IL-12OE plasmid

PrimerSequence(5′-3′)Target siteIL-12B-FWD1CGGACTAGTATGTGTCACCAGCAGTTGGTCAT p40 Forward IL-12B-REVCGCCACCGCCGCTTCCTCCGCCTCCGCTTCCGCCTCCGCCCCTGCAGGGCACAGATGCCp40 ReverseIL-12A-FWD1GAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGGCCp35 ForwardIL-12A-REVGCGGTCGACTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATCp35 ReverseIL12-SEQ1GCTCTCCACGCTTTGCCTGACIL-12seq primerIL12-SEQ2GATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATIL-12seq primerIL12-SEQ3CAAAGGCATTAAAGCAGCGTATCCIL-12seq primer

1.2.6IL-12在T细胞中的表达检测 收集体外培养14 d的T细胞上清，用ELISA检测上清中IL-12的表达水平。此外，为了探讨IL-12过表达的T细胞在遇到肿瘤细胞时是否有更高水平的表达，我们以1×105个/孔U251-luc铺96孔板，设置3个复孔，次日每孔加入2×105IL-12过表达及对照T细胞于CO2培养箱共孵育24 h后取上清行ELISA检测IL-12水平。

1.2.7T细胞表型分析 流式检测IL-12过表达及对照组T细胞的表型。具体方法为：在流式管中加入5×105个T细胞，用含1%FBS的PBS进行清洗一遍，100 μl PBS重悬细胞，分别加入3 μl抗体4℃孵育15 min，取出细胞，PBS清洗两遍后加入400 μl PBS流式检测。

1.2.8T细胞杀伤能力检测 将2×105肿瘤细胞U251-luc铺于96孔板，次日按1∶1、4∶1、16∶1的效靶比加入T细胞，T细胞的体积为100 μl，每个效靶比设置3个复孔。4 h后，吸出所有液体及细胞，以800 r/min离心5 min后，弃所有上清。以100 μl PBS重悬细胞后移入不透明的96孔板中，再加入100 μl 1 mg/ml的D-luciferin。立即使用酶标仪读取Luminal 560 nm的发射光读数。将只含有PBS和D-luciferin的孔内读数N0定义为零，将未加入T细胞，只含有靶细胞的孔内读数N定义为100，假设某孔读数为n ，则该孔内的细胞杀伤效率为：1-n/(N-N0)×100%。

为进行镜下直观观察，接种100 μl细胞数为1×105U251-luc于96孔板。次日，加入等体积等细胞数T细胞，放置CO2培养箱24 h后于倒置显微镜下观察T细胞的杀伤能力及刺激情况。

2 结果

2.1IL-12载体的成功构建 取5 μl扩增的p35、p40以及两者为模块扩增的IL-12全基因PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。从图2A中可以看出，3个片段分别在对应区域出现单一条带，其中p35大小为584 bp，p40为984 bp，IL-12全基因片段大小为1 622 bp。

在对克隆阳性筛选中，结果如图2B显示，在随机挑取的16个克隆快速扩增后有14个在对应的区域出现相应大小的特异条带，初步判断这些克隆为潜在的阳性克隆。为了进一步验证克隆序列的准确性，我们随机挑取2个克隆摇菌后提取质粒，测序结果证实所插入的序列为正确的基因序列。

2.2构建的IL-12可在T细胞中形成具有生物学活性的IL-12蛋白 为了探讨构建的IL-12是否具有完整的生物学活性，我们将IL-12通过电转方式导入T细胞。细胞电转12 h后流式检测质粒的电转效率，结果如图3A显示，对照组GFP表达率为46.1%，IL-12OE组为49.2%，因此本实验中使用的电转程序具有较高的电转效率。

为了检测构建的IL-12是否具有生物学活性及在肿瘤刺激下是否能进一步刺激IL-12的表达，我们用ELISA方法检测了培养14 d的细胞培养上清以及T细胞与神经胶质瘤U251共同作用24 h后上清中IL-12的水平。结果如图3B显示，在体外培养14 d时过表达IL-12 T细胞上清中有较高水平的IL-12蛋白[(122.55±13.8)pg/ml]，而在对照中几乎检测不到相应蛋白[(0.3±0.23)pg/ml]；当T细胞与肿瘤细胞混合(图3C)，非特异性肿瘤细胞对T细胞IL-12均有一定刺激作用,尤其对IL-12过表达T细胞能促使更高水平分泌IL-12[Control T cells刺激前后:(2.77±1.53)pg/ml vs (18.15±5.85)pg/ml；IL-12OE T cells刺激前后：(320.55±10.85)pg/ml vs (610.05±59.7)pg/ml]。

图2 IL-12基因的扩增及阳性克隆PCR的初步鉴定Fig.2 Amplification of IL-12 gene and positive clone screening with PCR array

图3 IL-12在T细胞中的转导效率及IL-12蛋白检测Fig.3 Transduction efficiency of IL-12 in T cells and IL-12 protein detection

图4 IL-12过表达T细胞与对照T细胞表型分析Fig.4 Phenotype analysis of IL-12OE T cells and control T cells

图5 T细胞杀伤实验Fig.5 Cell killing assay of T cells

2.3T细胞表型分析 流式检测体外扩增14 d T细胞CD3、CD4、CD8的表达水平。结果如图4所示，IL-12OE组与对照组CD4、CD8阳性T细胞数量之和均在98%以上，但 IL-12过表达T细胞组中CD4阳性细胞明显高于对照组(20.8% vs 5.25%)。

2.4IL-12分泌可促进T细胞的杀伤能力 T细胞杀伤实验结果如图5所示，虽然制备的T细胞没有靶向特异性，但在一定程度上仍具有非特异杀伤神经胶质瘤细胞U251的能力。其中过表达IL-12的T细胞较对照T细胞具有更强的杀瘤效果。显微镜下，IL-12的分泌能显著提高神经胶质瘤细胞对T细胞的刺激强度和增殖活性并形成大量T细胞克隆团(图5B)。

3 讨论

IL-12作为多效性细胞因子,是连接天然免疫与被动免疫的重要桥梁，是调动机体抗肿瘤免疫，改善肿瘤免疫抑制微环境的重要介质[7]。然而，大量临床前及临床实验研究显示IL-12大剂量直接输注给机体带来的毒副反应严重影响其临床疗效的评估及应用。如何安全高效向机体导入IL-12蛋白，充分发挥其免疫调控及抗瘤效应是推动IL-12临床应用亟待解决的问题[4,8,9]。

T细胞是抗肿瘤免疫的主要效应细胞。肿瘤细胞通过免疫逃逸得以在体内生长增殖。因此恢复T细胞对肿瘤抗原的识别和杀伤能力是抗肿瘤免疫的重要思路。近年以PD1/PD-L1免疫检测点抑制剂及嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR T)为代表的免疫疗法在临床，尤其血液系统肿瘤中取得的巨大成功充分验证了该思路的正确性[10]。然而，面对实体肿瘤，目前免疫疗法仍收效甚微，这与实体瘤瘤体的免疫抑制微环境密切相关。因此，改善肿瘤免疫抑制微环境，充分调动T细胞抗肿瘤免疫是免疫细胞在实体瘤治疗领域获得突破的重要途径[11]。

如前所述，IL-12无疑是改善肿瘤免疫抑制微环境的理想因子。因此，利用基因工程手段将IL-12引入肿瘤局部协同T细胞抗击实体瘤其理论可行。基于此，本研究我们利用基因工程手段构建IL-12基因，并利用PiggyBac转座子系统，借助电转导入T细胞后获得持续稳定的表达。IL-12分泌可进一步促进T细胞增殖，增强杀瘤活性。

以上结果显示，非病毒PiggyBac转座子系统是外源基因导入T细胞并获得持续稳定表达的有效工具。虽然目前在T细胞基因工程领域，病毒转导系统仍是主流，但该转导方式由于存在病毒复制、基因随机插入，宿主抗病毒免疫反应，制备过程复杂，价格昂贵等问题，仍需作进一步改进和补充。非病毒转座子系统由于在以上方面显示明显优势，近年在该领域获得迅速发展，我们的结果也表明该转导系统的有效性。此外，T细胞可作为IL-12的有效携带载体。这主要表现为：①T细胞利用自身的调控体系使IL-12维持一定水平的表达。在肿瘤刺激下IL-12分泌水平显著提高，这有利于在肿瘤局部形成高浓度IL-12；②IL-12的分泌可进一步促进T细胞增殖，提高CD4阳性细胞占比，这可能是该组细胞较对照组细胞有更好杀瘤效果的原因。在T细胞抗肿瘤免疫中，T细胞分化亚群是影响临床疗效的重要因素[12]。在此过程中CD8+细胞一直被认为是最重要的细胞亚群。然而，近年来愈来愈多的研究显示，CD4+细胞群在其中扮演的角色越发重要[12-15]，这可能是因为CD4+T细胞提供的生长因子和其他信号是维持输注的CTL功能和活性的重要保障[16-18]。对于携载IL-12的T细胞亚群中CD4+T细胞显著高于对照细胞，我们认为可能与IL-12细胞因子本身密切相关。如前所述，IL-12具有刺激淋巴细胞增殖的能力，因此携载IL-12的T细胞可能通过其分泌至血清中的IL-12促进培养体系中CD4+T细胞亚群的大量扩增。此外，IL-12在T细胞内部的表达亦可能影响T细胞内部细胞因子调控网络，从而对CD4+T的增殖产生影响。对该问题的回答仍需作进一步深入研究。

综上所述，本试验利用非病毒转导系统——PiggyBac转座子系统将IL-12高效导入T细胞并获得持续稳定的表达。初步显示T细胞是携载IL-12较为理想的工具。这将为后续开发靶向肿瘤抗原的CART细胞携载IL-12治疗实体瘤提供重要的技术及理论基础。