周岩 母汉友 王淑芬 汪瑞忠

【关键词】 原发性肝癌;细胞增殖;细胞侵袭;BUB1B

Clinical significance of BUB1B in hepatocellular carcinomaand its effect on proliferation and invasion of hepatoma cells Zhou Yan， Mu Hanyou，Wang Shufen， Wang Ruizhong. Department of Clinical Laborat-ory， Pudong New Area Peoples’ Hospital， Shanghai 201299， China

Corresponding author， Wang Ruizhong， E-mail： wrzhd@ qq. com

【Abstract】 Objective  To investigate the expression and clinical significance of BUB1B in patients with hepatocellular carcinomaand（HCC）， and to evaluate its effect on the proliferation and invasion of human liver cancer cells in vitro.  Methods The clinical data and the information of gene expression were collected from GEO database （GSE121248）. The differentially-expressing genes were screened and analyzed via bioinformatics analysis. A small interfering RNA vector was designed targeting BUB1B. The effect of BUB1B gene on the proliferation and invasion of liver cancer cells was assessed by silencing the expression of BUB1B gene. The knockdown efficiency was detected by quantitative real-time PCR. The proliferating and invasion abilities were evaluated by cell proliferation assay and wound healing test. The effect of the expression levels of BUB1B gene upon the clinical prognosis of HCC patients was assessed by KM-plotter database.  Results The silence sequences 1 and 2 could significantly silence the expression of BUB1B mRNA （t=8.41， P=0.001; t=10.43， P < 0.001）. The proliferating ability of hepatoma cell line HepG2， which knocked down the expression of BUB1B gene， was significantly weakened （t=13.94， P < 0.001）. The invasion ability was also reduced at 8 h after knocking down the expression of BUB1B gene （t=14.94， P < 0.001）. The survival rate of HCC patients with high expression of BUB1B gene （n=127） was significantly lower than that of their counterparts with low expression of BUB1B gene （n = 237） [HR = 2.01 （1.42 ～ 2.86）， P = 6.6×10-5]. Further analysis found that the expression of BUB1B gene exerted no effect on the clinical prognosis of HCC patients with a medical history of hepatitis （n = 150） [HR = 1.88 （0.89 ～ 3.99）， P=0.093]， whereas it acted as a molecular biomarker to predict the clinical prognosis of HCC patients without a medical history of hepatitis （n = 167） [HR = 2.84 （1.75 ～ 4.61）， P = 1.1×10-5].  Conclusions The BUB1B gene is highly expressed in HCC patients， which can promote the proliferation and invasion of liver cancer cells. BUB1B gene is a potential molecular biomarker for predicting the clinical prognosis of HCC patients with no medical history of hepatitis.

【Key words】 Hepatocellular carcinomaand;Proliferation;Invasion;BUB1B

原发性肝癌（HCC）目前在全球癌症相关死亡率中居第二位，且HCC在全球的发病率仍在上升，将很快超过100万/年的发病率[1-2]。HCC同样是我国常见的恶性肿瘤之一，患者主要集中在40 ～ 50岁，随着肝癌肿瘤标志物在HCC早期诊断中的应用，其早期治疗的总体疗效明显改善，但是病因和发病机制尚未确定[3-4]。研究HCC发生的相关分子机制以及寻找预测肝癌患者预后的标志物是临床诊治工作中面临的重要问题。最近研究表明纺锤体检测蛋白BUB1B（又名BUBR1）在肿瘤发生发展中存在重要意义，该蛋白是有丝分裂过程中重要的功能蛋白，在多种癌症发生中具有重要作用，但是在肝癌中的作用研究较少[5-8]。该研究主要从GEO数据库出发，筛选出HCC中高表达的差异表达基因BUB1B，通过小干扰RNA的方法沉默该基因表达，研究BUB1B基因对肝癌细胞增殖、侵袭以及对HCC患者预后的影响。

对象与方法

一、临床资料的获取与差异基因筛选

选择NCBI网站的Gene Expression Omnibus（GEO） 数据库，在NCBI主页的搜索下拉菜单中选择GEO DataSets，搜索hepatocellular carcinomaand关键词，在左边项目栏中依次选择Series、Expression profiling by array和tissue，在右边Top Organisms中选择Homo sapiens，在检索的目录中选

择GSE121248数据集[9]。该数据集显示了107例HCC患者的临床信息以及基因表达信息，包括70例HCC组织和37例癌旁组织。下载得到该芯片的原始数据CEL格式文件以及临床信息表格Series Matrix Files， 将数据导入Agilent 公司的软件Gene SpringGX，分析得到差异表达基因。

二、生存分析

生存分析中的HCC患者来自KM-plotter数据库，包括364例HCC患者，具体临床信息包含是否有肝炎病毒感染史等信息[10]。通过选择对应的筛选条件获得生存曲线。

三、实验仪器及材料

实验仪器：美国Applied Biosystems公司7300 实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf公司的冷却离心机，美国Thermo Fisher公司的恒温CO2细胞培养箱和超净工作台。Nikon公司细胞倒置显微镜。

实验材料：天根公司的RNA提取试剂盒和反转录试剂盒，Biotool公司的SYBR Green荧光染料real-time PCR试剂盒，胎牛血清FBS和DMEM高糖培养基购买自Hyclone公司，双抗（青霉素+链霉素）购买自Gibco公司，转染试剂Lipofectamine 2000购买自美国Thermo Scientific公司，siRNA-BUB1B购买自拓然生物。

四、实验方法

1. 细胞转染

转染前1 d将HepG2细胞铺板，转染时密度约70%，在250 μl Opti-MEM培养基中加入5 μl siRNA-BUB1B混匀，在250 μl Opti-MEM培养基中加入5 μl Lipofectamine 2000转染试剂混匀，静置5 min后，将siRNA混合液滴入转染试剂混合液中，静置20 min，滴入细胞上清中，4 ～ 6 h后换含有FBS的DMEM培养基，48 h后检测沉默效率。（沉默序列1：CGGAAGAAGATCTAGATGT，沉默序列2：AGCAGAGTTGTCTAAGCCT）。

2. 荧光定量PCR

用天根RNA抽提试剂盒提取细胞RNA，将抽提的RNA用反转录试剂盒反转录成cDNA，利用Biotool公司的SYBR Green试剂盒检测BUB1B基因的mRNA表达水平。BUB1B上游引物：5’- CTCGTGGCAATACAGCTYCA-3’，下游引物：5’- CTGGTCAATAGCTCGGCTTC-3’。内参GAPDH上游引物：5’-CTACA ATGAGCTGCGTGTGG-3’，下游引物：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’。采用两步法扩增程序：95℃30 s，1个循环;95℃15 s，60℃1 min，40个循环;95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，1个循环。

3. 细胞增殖

将转染siRNA-BUB1B与对照组细胞分别种到6孔板中，每个细胞种4个复孔，分别在第3、5日将细胞消化下来，进行细胞计数，根据细胞数目画折线图。

4. 划痕实验

将转染siRNA-BUB1B与对照组细胞分别种到6孔板中，待细胞长满后，用细胞刮子在每个孔中按照预先划好的辅助线进行划直线，将划好线的细胞用无FBS的DMEM培养8 h，显微镜下拍照，并统计划痕距离，从而反映细胞的侵袭能力。

五、统计学處理

采用GraphPad Prism 5进行作图以及统计学分析，BUB1B基因的沉默效率检测，细胞增殖实验（细胞数目），GEO数据库中HCC差异表达基因以及细胞迁移距离采用独立样本t检验， P < 0.05为差异有统计学意义，采用Kaplan-Meier曲线以及log-rank检验分析BUB1B表达与HCC患者预后间的关系。

结 果

一、GEO数据库筛选出BUB1B在HCC患者中高表达

收集GSE121248数据集中HCC患者的肝癌组织以及癌旁正常组织的基因表达数据，利用生物信息学分析肝癌组织中相比较于癌旁正常组织差异表达的基因（图1 A），根据筛选规则（P < 0.05，fold change > 2），获得差异表达基因表达的火山图（图1B），其中纺锤体检测点蛋白BUB1B在肝癌组织中明显高表达（表1）。

二、BUB1B促进肝癌细胞的增殖及侵袭能力

BUB1B基因在肝癌组织中高表达，但是其生物学作用并不清楚，我们利用小干扰RNA将肝癌细胞系HepG2中BUB1B基因表达沉默。通过细胞转染技术，将该小干扰RNA过表达于HepG2细胞中，实时荧光定量PCR技术检测该基因的沉默效率。沉默序列1（si-BUB1B-1）和2（si-BUB1B-2）均能有效地沉默BUB1B在HepG2中mRNA的表达（图2A）（沉默1：t = 8.41， P = 0.001; 沉默2：

t = 10.43，P <0.001）。将低表达BUB1B基因的HepG2细胞与对照组HepG2细胞分别铺在6孔板中（2×105），分别在第3、5日用细胞计数的方法反映这两株细胞系的增殖能力，我们发现将BUB1B基因表达沉默后，细胞在长到第3日时细胞数目与对照组细胞相比并没有差异（t = 2.60， P = 0.060），而在第5日的时候，沉默BUB1B表达的细胞的增殖能力弱于对照组细胞（t = 13.94， P < 0.001），见图2B。除此之外，细胞划痕实验表明，缺少BUB1B基因表达的肝癌细胞，其细胞侵袭能力与对照组细胞相比明显减弱，见图2C，划痕8 h后，细胞迁移形成的划痕距离在2株细胞（对照组细胞与沉默2细胞）中具有统计学差异（t = 14.94，P < 0.001），见图2D。

三、BUB1B是预测HCC患者预后的一个分子标志物

BUB1B基因不仅在肝癌细胞的生长和迁移中具有重要作用，而且在HCC患者预后中同样具有重要作用。我们在KM-plotter数据库中收集了364例HCC患者的预后以及基因表达信息，试图阐明BUB1B在HCC患者预后中的作用。在HCC患者中（包括肝炎病毒感染者和未感染者），高表达BUB1B（n = 127）的HCC患者的生存率差于低表达BUB1B（n=237）的HCC患者[HR = 2.01（1.42 ～ 2.86），P = 6.6×10-5]，见图3。

肝炎病毒感染是肝癌发生过程中主要的危险因素，我们从364例HCC患者中细分出感染肝炎病毒的HCC患者（n=150）和未感染肝炎病毒的HCC患者（n=167），在2组患者中根据BUB1B基因表达的高低分为BUB1B高表达组和BUB1B低表达组，通过Kaplan-Meier生存曲线分析，我们发现只有在未感染肝炎病毒的HCC患者中，BUB1B高表达组的预后差于BUB1B低表达组[HR = 2.84（1.75 ～ 4.61），P =1.1×10-5]，见图4A。而在感染肝炎病毒的HCC患者中，BUB1B高表达组与BUB1B低表达组的生存曲线差异没有统计学意义[HR=1.88（0.89 ～ 3.99），P = 0.093]，见图4B。

讨 論

我们研究发现纺锤体检测点蛋白BUB1B在肝癌中高表达，该蛋白的高表达促进了肝癌细胞的增殖与侵袭，进一步研究发现，BUB1B分子的表达可以作为预测HCC患者预后的一个指标，尤其是未感染肝炎病毒的HCC患者，这为临床诊断HCC以及判断HCC患者的预后提供了理论基础。

HCC严重威胁人类的生存和健康，尤其是在中国。尽管甲胎蛋白是诊断HCC的最佳标志物，但是仍有10% ～ 20%的HCC容易漏诊[11]。肝癌诊断的标志物比如异常凝血酶原、癌胚抗原、癌抗原（CA199）等在HCC的诊断中具有重要意义[12-14]。除此之外，多种肿瘤标志物联合应用对HCC诊断的敏感度以及特异度同样具有重要的意义。尽管多种肿瘤标志物联合应用可以辅助诊断HCC，但是由于HCC诱发因素以及病理类型较复杂，在诊断肝癌过程中还有许多盲点，我们发现BUB1B在HCC中表达增加，且与肝癌细胞的增殖和侵袭有关，有望成为诊断的潜在标志物。但是BUB1B与甲胎蛋白在HCC中的表达比较在此并未涉及，后续研究将集中在比较BUB1B与甲胎蛋白作为HCC诊断分子标志物上的差异，阐明BUB1B在诊断某种特定HCC中的作用以及与甲胎蛋白联合应用诊断HCC的特异性。

HCC发生过程中的两大诱因主要是酒精与肝炎病毒的感染[15-16]。肝炎-肝硬化-肝癌是肝癌发生的三部曲，乙型病毒性肝炎是发展中国家诱发肝癌的主要因素，尽管80% ～ 90%的HCC患者是由于慢性肝炎转变成肝硬化的过程中肝细胞癌化而进展成HCC，但是仍有部分HCC患者未曾感染肝炎病毒[17]。肝炎病毒感染诱导HCC的发生机制已经研究的较为透彻，而未感染肝炎的肝癌发生机制反而研究相对较少[18-19]。本研究发现BUB1B在未感染肝炎的HCC患者中，可以作为预测HCC患者预后的理想分子标志物，反而在肝炎病毒感染诱发的HCC患者中，BUB1B的表达与HCC患者的预后没有太大关系，该结果可能暗示肝炎病毒的感染对BUB1B的分子表达具有一定影响，我们之后的工作也将主要集中在BUB1B在HCC中表达的分子机制。

综上所述，我们通过HCC患者临床大数据的差异基因筛选，发现纺锤体检测点蛋白BUB1B在肝癌中高表达，体外实验发现BUB1B的表达促进了肝癌细胞的增殖与侵袭，并且与HCC患者的预后有关，尤其是未感染肝炎病毒的HCC患者，该分子的表达可以作为预测HCC患者预后的分子标志物。

参 考 文 献

[1] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， Siegel RL， Torre LA， Jemal A.Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2] Llovet JM， Montal R， Sia D， Finn RS.Molecular therapies and precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nat Rev Clin Oncol，2018，15（10）：599-616.

[3] 陳万青，郑荣寿，张思维，曾红梅，邹小农，赫捷.2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析.中国肿瘤，2017，26（1）：1-7.

[4] 薛才林，杨涛，古诚鑫，蒋小峰，钱世鹍，刘世明，杨辉.溴结构域蛋白4抑制剂JQ1促使肝癌细胞侵袭迁移的分子机制.新医学，2017，48（7）：443-448.

[5] Pinto M， Vieira J， Ribeiro FR， Soares MJ， Henrique R， Oliveira J， Jerónimo C， Teixeira MR.Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1 and BUBR1 is associated with genomic complexity in clear cell kidney carcinomas. Cell Oncol，2008，30（5）：389-395.

[6] Baker DJ， Dawlaty MM， Wijshake T， Jeganathan KB， Malureanu L， van Ree JH， Crespo-Diaz R， Reyes S， Seaburg L， Shapiro V， Behfar A， Terzic A， van de Sluis B， van Deursen JM.Increased expression of BubR1 protects against aneuploidy and cancer and extends healthy lifespan. Nat Cell Biol，2013，15（1）：96-102.

[7] Ding Y， Hubert CG， Herman J， Corrin P， Toledo CM， Skutt-Kakaria K， Vazquez J， Basom R， Zhang B， Risler JK， Pollard SM， Nam DH， Delrow JJ， Zhu J， Lee J， DeLuca J， Olson JM， Paddison PJ.Cancer-specific requirement for BUB1B/BUBR1 in human brain tumor isolates and genetically transformed cells. Cancer Discov，2013，3（2）：198-211.

[8] Abal M， Obrador-Hevia A， Janssen KP， Casadome L， Menen-dez M， Carpentier S， Barillot E， Wagner M， Ansorge W， Moeslein G， Fsihi H， Bezrookove V， Reventos J， Louvard D， Capella G， Robine S.APC inactivation associates with abnormal mitosis completion and concomitant BUB1B/MAD2L1 upregul-ation. Gastroenterology，2007，132（7）：2448-2458.

[9] Barrett T， Wilhite SE， Ledoux P， Evangelista C， Kim IF， Tomashevsky M， Marshall KA， Phillippy KH， Sherman PM， Holko M， Yefanov A， Lee H， Zhang N， Robertson CL， Serova N， Davis S， Soboleva A.NCBI GEO： archive for functional genomics data sets——update. Nucleic Acids Res，2013，41（Database issue）：D991-D995.

[10] Lánczky A， Nagy Á， Bottai G， Munkácsy G， Szabó A， Santarpia L， Győrffy B.miRpower： a web-tool to validate survival-associated miRNAs utilizing expression data from 2178 breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat，2016，160（3）：439-446.

[11] Lersritwimanmaen P， Nimanong S. Hepatocellular carcinoma surveillance： benefit of serum alfa-fetoprotein in real-world practice. Euroasian J Hepatogastroenterol，2018，8（1）：83-87.

[12] Inagaki Y， Tang W， Makuuchi M， Hasegawa K， Sugawara Y， Kokudo N. Clinical and molecular insights into the hepatocellular carcinoma tumour marker des-γ-carboxyprothrombin. Liver Int，2011，31（1）：22-35.

[13] Lee JH， Lee SW.The Roles of carcinoembryonic antigen in liver metastasis and therapeutic approaches. Gastroenterol Res Pract，2017，2017：7521987.

[14] Ma B， Liu X， Yu Z.The effect of high intensity focused ultras-ound on the treatment of liver cancer and patients’ immunity. Cancer Biomark，2018. [Epub ahead of print]

[15] Chen XZ， Zhang WK， Tang HB， Li XJ， Tian GH， Shang HC， Li YS. The ethanol supernatant extracts of liushenwan could alleviate nanodiethylnitrosamine-induced liver cancer in mice. Can J Gastroenterol Hepatol，2018，2018：6934809.

[16] Ispas S， So S， Toy M. Barriers to disease monitoring and liver cancer surveillance among patients with chronic hepatitis B in the United States. J Community Health，2018. [Epub ahead of print]

[17] Tellapuri S， Sutphin PD， Beg MS， Singal AG， Kalva SP.Staging systems of hepatocellular carcinoma： a review. Indian J Gastroenterol，2018，37（6）：481-491.

[18] Tu T， Bühler S， Bartenschlager R.Chronic viral hepatitis and its association with liver cancer. Biol Chem，2017，398（8）：817-837.

[19] Islami F， Dikshit R， Mallath MK， Jemal A.Primary liver cancer deaths and related years of life lost attributable to hepatitis B and C viruses in India. Cancer Epidemiol，2016，40：79-86.

（收稿日期：2019-01-18）

（本文編辑：杨江瑜）