庞学丰 陈舒茵 梁国成 方建康 冯玉青 黄敏 陈壮 江丽芬 唐丽萍 李玉玲 黄政治 廖家瑜

【摘 要】目的：优选止痛祛风胶囊的提取工艺，并制定其质量标准草案。方法：采用正交试验，以提取的干膏得量及其总黄酮含量为指标，筛选制剂的最佳提取工艺;再研究制剂成型后的各项常规检查，制定制剂的质量标准草案。结果：优选的提取工艺达到预期目的，优化最佳提取工艺为以10倍量溶剂，浸泡0.5 h，提取2次，每次提取时间1.5 h;制定的质量标准草案符合实际、操作简便、稳定可靠。结论：优选出的制备工艺和质量标准草案合理可行，简便稳定，可操作性强，结果满意。

【关键词】 痛风性关节炎;止痛祛风胶囊;提取工艺;质量标准

近年来，随着经济的发展，生活方式和饮食结构的改变，蛋白质类食品摄入成倍增长，痛风的发病率逐年上升，且越来越年轻化[1]。痛风性关节炎极易反复发作，很多患者迁延难愈而进入慢性期，后期会导致骨破坏，影响关节功能，严重影响患者的生活质量[2-4]。痛风性关节炎多以西药治疗，虽有一定疗效，但长期服用不良反应多，患者难以坚持，目前尚无特效药物和根治藥物[5-6]。国内亦有学者利用中医药对本病进行研究，也取得了一定的疗效[7-12]，但还有诸多问题未能解决。因此，研究开发新的有效药物，尤其是疗效肯定、不良反应少的中药、中成药尤为必要。

止痛祛风汤是笔者在多年临床实践中总结出来的治疗痛风性关节炎的经验方，由白芍、知母、萆薢、肿节风、忍冬藤、葫芦茶、两面针、葛根、桂枝、土茯苓、甘草等药物组成。在临床研究和动物实验中，笔者发现，其能明显缓解关节疼痛、肿胀等症状，改善相关生化指标，具有消肿止痛效果好和不良反应少的特点。基于此，笔者拟对具有良好前期研究基础的止痛祛风汤进行系统研究，加以开发制成胶囊剂。本文旨在研究探讨止痛祛风胶囊的制备工艺，并对其中发挥疗效之一的总黄酮进行含量测定，制定制剂质量标准草案，以保证制剂的疗效及其质量的稳定、可靠。

1 实验材料

1.1 仪 器 分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号AL204];高精密度计数计重天平（深圳市信诺普衡器，型号ACS-JZ）;电热恒温水浴箱（北京科伟永兴仪器有限公司，型号HH-S8）;低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司，型号DLSB-5L/10）;超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂，型号CQ-250）;可见透射紫外反射仪（上海精科实业有限公司，型号WFH-205B）;紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂 白芍、知母、萆薢等药材购自广西德润堂中药科技有限公司，均符合《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）2015版一部各药项下规定;芒果苷对照品（中国食品药品检定研究院，生产批号111607-201704）;乙醇（上海沃凯生物技术有限公司，分析纯）;纯化水（自制）。

2 方法和结果

2.1 提取工艺研究

2.1.1 提取方法 先将药材于60 ℃下干燥2 h，依法准确称取处方量药材，置于煎煮锅中，加一定量纯化水，浸泡一定时间;加热至沸腾，保持微沸一定时间;滤过，依法再煎煮;再滤过，合并滤液;浓缩至干膏，记录所得干膏量;并以紫外-可见光吸收光谱（UV-VIS）测定总黄酮含量，考察各影响因素，确定最佳的提取工艺。

2.1.2 正交试验设计 经预试验考察，影响本制剂提取工艺的因素主要有药材浸泡时间（A）、提取溶剂用量（B）、提取时间（C）以及提取次数（D），故本试验对这4个因素进行L9（34）正交试验考察。见表1至表5。

以干膏得量为指标，通过表3结果比较得知，各因素影响提取效果的主次为：D > A > B > C;直观分析得知，各因素中：A1 > A2 > A3，B2 > B1 > B3，C3 > C1 > C2，D3 > D2 > D1;由表4方差分析得知，各因素均无显著影响，直接以直观分析结果组合，即组合为A1 B2 C3 D3。

以总黄酮含量为指标，通过表3试验结果比较得知，C与A有显著影响，各因素影响提取效果的主次为：C > A > B > D;直观分析得知，各因素中：A2 > A1 > A3，B2 > B1 > B3，C2 > C3 > C1，D2 = D3 > D1;由表5方差分析得知，因素C影响极显著，因素A影响显著，因素B有一定影响，综合考虑，即组合为A2 B2 C2 D2（D3）。

根据表3综合直观分析，以干膏得量比较时，A1高于A2，C2高于C3;以总黄酮含量比较时，A1与A2相差不大，C2与C3也相差较小，故选择A1与C2。D2与D3对提取贡献率一致，考虑能源损耗与工艺耗时，宜选D2。因此，根据各因素影响重要主次和贡献率得出，最佳提取工艺为A1 B2 C2 D2，即用10倍量溶剂浸泡0.5 h，提取2次，每次提取时间1.5 h。

2.1.3 提取工艺验证 准确称取经60 ℃下干燥

2 h的处方量药材，置于煎煮锅中;加10倍量纯化水，浸泡0.5 h;后煮沸进行提取1.5 h，滤过;药渣再加10倍量纯化水，煮沸提取1.5 h，滤过;合并滤液，浓缩至干膏，记录所得干膏量;并以UV-VIS测定总黄酮含量，验证优选工艺的可行性。见表6。

2.2 质量控制研究

2.2.1 制 法 称取白芍、知母、萆薢等处方量药材，加10倍量水浸泡0.5 h;煎煮2次，每次1.5 h;滤过，合并药液;浓缩成干膏，以80目筛粉碎成细粉;加入适量滑石粉和硬脂酸镁，混合均匀后填充胶囊，制成1000粒，即得。

2.2.2 性 状 本品为硬胶囊，内容物为棕黄色的粉末，味微苦。

2.2.3 鉴 别 土茯苓[13]：取本品粉末10 g和缺土茯苓阴性样品10 g，分别加甲醇50 mL，超声30 min处理，滤过，浓缩至5 mL，作为供试品溶液与阴性样品溶液。另外以电子天平精密称定为10.07 mg的落新妇苷对照品，以甲醇充分溶解于10 mL容量瓶中，并定容至刻度线，作为对照品试液。依照《中国药典》2015版四部通则0502薄层色谱法，取上述供试品、对照品和阴性样品溶液各20 μL，分在同一硅胶G薄层板点样后，在层析缸中展开[展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸（13∶32∶9）]，取出后自然晾干，以AlCl3试液均匀喷淋，放置5 min充分反应后，于365 nm紫外光灯下检视。在相应位置，供试品和对照品色谱应显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品对应位置应无干扰，见图1（1）。

白芍[13]：取本品粉末10 g和缺白芍阴性样品10 g，分别加乙醇50 mL，超声20 min处理，滤纸滤过，蒸干滤液后，用5 mL甲醇溶解残渣，作为供试品试液和阴性样品试液。另取芍药苷对照品，精密称定为10.11 mg，置于10 mL容量瓶中，以甲醇充分溶解后定容至刻度线，作为对照品试液。依照《中国药典》2015版四部通则0502薄层色谱法，吸取上述供试品、对照品和阴性样品溶液各20 μL，在同一硅胶G薄层板点样后，在层析缸中展开[展开剂：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）]，取出后自然晾干，均匀喷淋香草醛硫酸溶液（质量分数为5%），放置烘箱中加热至斑点显色清晰。在相应位置，供试品和对照品色谱应显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品对应位置应无干扰，见图1（2）。

两面针[13]：取本品粉末10 g和缺两面针阴性样品10 g，分别加乙醇50 mL，超声60 min处理，滤纸滤过，蒸干滤液后，用5 mL甲醇溶解残渣，作为供试品试液和阴性样品试液。另取两面针对照药材，精密称定为1.053 9 g，同法制成对照药材溶液。依照《中国药典》2015版四部通则0502薄层色谱法，吸取上述供试品、对照品和阴性样品溶液各20 μL，在同一硅胶G薄层板点样后，在层析缸中展开[展开剂：三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（30∶1∶0.2）]，取出后自然晾干，均匀喷淋硫酸乙醇溶液（体积分数为10%），放置烘箱中加热至斑点显色清晰，于365 nm紫外光灯下检视。在相应位置，供试品和对照品色谱应显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品对应位置应无干扰，见图1（3）。

葛根[13]：取本品粉末10 g和缺葛根阴性样品10 g，分别加50 mL甲醇溶解，超声60 min处理，滤纸滤过，蒸干滤液后，用0.5 mL甲醇使溶解残渣，作为供试品试液和阴性样品试液。另取葛根对照药材，精密称定为1.163 1 g，同法制成對照药材溶液。依照《中国药典》2015版四部通则0502薄层色谱法，吸取上述供试品、对照品和阴性样品溶液各20 μL，在同一硅胶G薄层板点样后，在层析缸中展开[展开剂：三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）]，取出后自然晾干，于365 nm紫外光灯下检视。在相应位置，供试品和对照品色谱应显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品对应位置应无干扰，见图1（4）。

2.3 胶囊的质量检查

2.3.1 水分 按照《中国药典》2015版四部通则0832水分测定法（第二法）的测定，不得超过9.0%[13]。操作方法：取本品3个批号，分别取出内容物各2 g，精密称定，平铺于扁形称量瓶（事先干燥至恒重）中;再精密称定质量，敞开瓶盖，置于烘箱中，100～105 ℃干燥5 h;盖好瓶盖，移置干燥器中，冷却30 min后再次精密称定;后继续放于烘箱中，再100～105 ℃干燥1 h，冷却，称质量，直至连续2次称质量之差不超过5 mg。依法计算样品的含水量（%），生产批号分别为20180604，20180607，20180612，对应的含水量分别为4.27%、4.45%、4.42%，水分 < 9.0%，符合规定。

2.3.2 装量差异检查 按照《中国药典》2015版四部通则0103胶囊剂项下[装量差异检查]法，检查每粒装量差异，不得超过±10.0%[13]。操作方法：分别精密称定本品10粒胶囊质量，倒出其中药粉（注意避免损坏囊壳），以适当工具将胶囊壳内药粉清理干净，取胶囊壳精密称定质量，计算每粒胶囊中所装药粉的质量。与标示装量比较，不得出现2粒以上的装量超出装量差异限度的胶囊，并且不得出现超出装量差异限度1倍的情况，检查结果见表7，符合规定。

2.3.3 崩解时限 按照《中国药典》2015版四部通则0921崩解时限检查法，进行检测[13]。检测方法：取6粒本品胶囊，分别放入升降式崩解仪吊篮的玻璃管中进行检查，每粒胶囊均应在30 min内全部崩解，生产批号分别为20180604，20180607，20180612，对应的崩解时限分别为18.47 min、17.31 min、17.52 min，符合规定。

2.4 含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称定5.08 mg的芒果苷，以体积分数为70%乙醇溶解并置于50 mL容量瓶中超声溶解，静置冷却至室温;用体积分数为70%乙醇定容，即制成每1毫升含0.101 6 mg对照品溶液，备用。

2.4.2 供试品溶液的制备 取止痛祛风胶囊内容物，精密称定50 mg，置于50 mL容量瓶中，以体积分数为70%乙醇溶解并稀释至刻度线，超声提取1 h，冷却至室温;用体积分数为70%乙醇补足至刻度，摇匀，过滤;滤去初滤液，取续滤液10 mL，转移至50 mL的容量瓶中;以体积分数为70%乙醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.4.3 检测波长选择 分别取对照品溶液和供试品溶液，以体积分数为70%乙醇溶液为空白试剂，进行紫外全波长扫描[14-15]，结果色谱图显示，在波长为380 nm处，芒果苷对照品试液与供试品试液共同产生明显吸收峰，且空白试剂无干扰。结果见图2。

2.4.4 线性及线性范围的考察 取芒果苷对照品试液，各精密吸取1，2，4，6，8 mL，置容量瓶（10 mL）中，以乙醇（体积分数为70%）溶解、稀释到刻度，摇匀后进行紫外测定，对吸光度和溶液质量分数（mg·mL-1）绘制标准曲线，回归方程为Y = 6.061 7 X + 0.012 3（R2 = 0.999 3），表明芒果苷对照品在0.0102 ～ 0.0816 mg·mL-1质量分数范围内，呈现良好的线性关系，见图3。

2.4.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液，在380 nm波长下，连续测定5次，得到吸光度分别为0.451，0.457，0.465，0.469，0.461，RSD = 1.52%，表明精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，380 nm波长下，分别于0，1，3，6，9，12 h测定，得到吸光度分别为0.472，0.454，0.452，0.461，0.477，0.477，RSD = 2.13%，表明样品的稳定性（12 h内）良好。

2.4.7 重现性试验 取同一批次的5份供试品，分别按2.5.2项下平行制备供试品试液，测定所得吸光度分别为0.459，0.473，0.454，0.478，0.472，RSD = 2.22%，表明样品重现性良好。

2.4.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的5份供试品，加入芒果苷对照品（事先已精密称定），依2.5.2项下平行制备供试品试液，测定总黄酮含量，并计算加样回收率。结果平均回收率90.09%，RSD = 2.70%，结果见表8。

2.4.9 样品含量测定 取不同3个批次的止痛祛风胶囊（样品批号为180604，180607，180612），分别按2.5.2项下平行制备供试品试液，依法测定对应的总黄酮含量分别为0.035 mg·mg-1、0.034 mg·mg-1、0.035 mg·mg-1。

3 讨 论

止痛祛风汤是笔者在多年临床实践中总结出来的经验方，由白芍、知母、萆薢、肿节风、忍冬藤、葫芦茶、两面针、葛根、桂枝、土茯苓、甘草等组成，具有清热解毒、活血、祛风除湿、通络止痛之功效，临床应用及实验研究表明其对痛风性关节炎有确切的疗效[11-12，16]。本方从中医整体观出发，辨证论治，整体把握痛风性关节炎的病因及其发展变化规律，利用多味中药、多种成分相互协调配合实现扶正祛邪的作用。

黄酮类化合物广泛存在于瓜果蔬菜以及多数中药中，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血压等作用，其根据基本骨架中官能团的种类和连接位置等不同，分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、查尔酮、黄烷醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢异黄酮等，通常提取黄酮类化合物的方法主要有系统溶剂法、热水提取法、超声提取法、碱溶液提取法和酶浸渍法等。研究显示，黄酮类化合物是防治痛风性关节炎的有效成分之一[17-19]，作用机制主要是通过减轻机体的痛敏反应，抑制类二十烷酸生成酶，如磷脂酶A2、环氧合酶-2（COX-2）和5-脂氧化酶等的产生和活性，以及降低前列腺素和白三烯的水平，抑制COX-2、一氧化氮合酶的基因表达以减少一氧化氮与父系表达基因2的表达等[20-21]。本方中知母、萆薢、肿节风、忍冬藤、葫芦茶、葛根、土茯苓和甘草等均含黄酮类化合物，故黄酮类化合物也是止痛祛风胶囊的重要药效成分之一。因此，本研究以提取的干膏得量及总黄酮化合物含量为指标，考察提取工艺，以UV-VIS测定总黄酮的含量并进行方法学验证，最后进行质量标准研究，确保制剂的有效和稳定。

关于对照品和对照药材的选择，因为中药是多种成分的有机结合，呈多样性和复杂性而又相互协调的特点，故对中药的质量评价，须要求以合适的标准物质作参照。根据国际标准物质的选择依据，其中就有标准物质要有代表性和同质性的要求，代表性即要求其应有足够的取样数量和梯度范围，以使标准物质的量值梯度能充分满足样品的检测要求[22];要求候选物应与被测定物相一致或尽可能接近，以消除基体效应所引入的系统误差[23]，即要求作为标准物质的对照品应与被测样品具有相同或近似的生物效价，以尽可能全面把控被测物，体现中药和中药复方制剂多成分、多靶点相互协调作用的整体效应。故本实验定性鉴别所采用的标准物质尽可能为对应的对照药材。

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收稿日期：2019-01-02;修回日期：2019-03-22