王贵芳 王文茹 张淑辉 相昆 徐颖 张美勇

摘要：为研究核桃果实油脂合成与积累的分子调控机理，以核桃果实种仁cDNA为模板克隆得到油脂合成关键转录因子JrWRI1基因，其cDNA序列全长为1 230 bp，编码409个氨基酸。通过对其结构特征、生物学特性进行分析，发现该基因编码蛋白属于AP2/ERF转录因子超级家族，具有特异的DNA结合序列，调节生物合成和代谢过程，定位于细胞核中，符合转录因子行使功能的特点。并构建了JrWRI1超表達重组载体，为进一步研究JrWRI1在核桃果实油脂合成与积累过程中的功能奠定基础，也为利用分子手段加快高油核桃新品种的选育提供参考。

关键词：核桃;果实;油脂;转录因子;JrWRI1

中图分类号：S664.103文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）02-0001-06

Cloning and Bioinformatics Analysis of Transcription Factor

JrWRI1 Gene Related with Lipids Synthesis of Walnut

Wang Guifang  Wang Wenru  Zhang Shuhui  Xiang Kun  Xu Ying  Zhang Meiyong

（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2.College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

AbstractIn order to study the molecular regulation mechanism of lipids synthesis and accumulation in walnut fruits， a gene JrWRI1， the key transcription factor for lipids synthesis， was cloned from walnut seeds. The cDNA sequence of JrWRI1 was 1 230 bp encoding 409 amino acids. Through the analysis of structural and biological characteristics， it was found that the gene JrWRI1 belonged to the AP2/ERF transcription factor superfamily， which had specific DNA binding sequence， regulated the biosynthesis and metabolic process， and was located in the nucleus， so it was conformed to the characteristics of transcription factor performing functions. The over-expression recombinant vector of JrWRI1 was constructed， which laid a foundation for further study on the functions of JrWRI1 in the oil synthesis and accumulation in walnut seeds， and provided a reference for accelerating the selection and breeding of new varieties of high-oil walnut by molecular means.

KeywordsWalnut; Fruit; Lipids; Transcription factor; JrWRI1

核桃（Juglans regia L.）在我国分布范围广、栽培历史悠久，在保障我国粮油安全和退耕还林方面扮演重要角色[1]。近年来，我国植物油消费量持续增长，需求缺口不断扩大，对外依存度明显上升，食用植物油安全问题日益突出。为增加健康优质食用油的供给，切实维护国家粮油安全，2014年国务院颁布《关于加快木本油料产业发展的意见》，提出大力发展油茶、核桃、油用牡丹等木本油料树种，到2020年产出木本食用油150万吨左右。高含油量新品种的选育是提高食用油产量的重要途径。因此，提高核桃种仁含油量、改善其内在品质成为核桃育种的当务之急。与传统育种方法相比，分子育种年限更短，对性状的操作更精确[2，3]。

WRI1是模式植物油脂合成的关键转录因子，在拟南芥中首次被发现[4]，与野生型相比，突变体wri1不能正常地将葡萄糖和蔗糖转化成脂肪酸合成的前体物质，种子的含油量降低80%，己糖激酶、磷酸果糖激酶等几个糖酵解酶的活性降低，且种皮表面皱缩，因此被命名为WRINKLED1（WRI1）。WRI1蛋白在N端和C端各有1个与DNA结合的AP2/EREBP结构域，其中AP2结构域非常保守，是APETALA2（AP2）家族的一员[5]。在拟南芥中过表达甘蓝型油菜（Brassica napus）WRI1同源基因使种子的油脂含量上升10%～40%[6]。在甘蓝型油菜中过表达BnWRI1，则花期提前，种子中油脂积累提高18%～38%，叶片中提高28%～63%[7]。在单子叶植物二穗短柄草的叶片中异位表达BdWRI1使叶片中的油脂积累提高32.5倍，游离脂肪酸含量提高2倍;AtWRI1基因在拟南芥中超表达不仅使种子的含油量增加，而且引起幼苗积累三酰甘油[8]。An等[9]将AtWRI1基因在油料作物亚麻荠中超表达，得到的植株比野生型产油量提高了14%。可见，超表达转录因子WRI1编码基因能够提高植物种子的油脂含量。柴国华等[10]用RNAi技术干扰油菜内源WRI1基因的表达，则降低了种子的含油量。

大量试验证明WRI1作为模式植物油脂合成的关键转录因子，在提高植物种子含油量方面具有极高的应用价值，但WRI1在木本油料树种核桃果实油脂合成与积累中的作用机理仍不清楚，这极大地限制了分子育种在核桃育种上的应用。2015年，张通[11]利用高通量数字基因表达谱技术从核桃中发现了WRI1基因。本研究通过克隆转录因子JrWRI1基因，对其结构、分子生物学功能进行分析，构建原核重组表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达，为进一步研究JrWRI1基因在核桃果实油脂合成与积累中的功能奠定基础，也为利用分子手段加快高油核桃新品种的选育提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2017年4月至2018年3月在山东省果树生物技术育种重点实验室、山东省干果育种工程技术研究中心和国家苹果工程技术研究中心进行。

植物材料为‘香玲核桃果实，采自山东省泰安市国家核桃种质资源圃。选取晴天上午进行采样，采样时间为2017年4—8月，核桃种仁总RNA提取样品于液氮中迅速冷冻，保存于-80℃冰箱;核桃果实发育动态样品带回实验室进行解剖、观察及拍照。

1.2核桃种仁总RNA的提取及JrWRI1基因的克隆、转化

以‘香玲核桃种仁为试材提取总RNA，采用OMEGA植物组织总RNA提取试剂盒，反转录cDNA第一链采用宝生物反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit （Perfect Real Time），参照说明书进行操作。目的基因JrWRI1的克隆参照GenBank登录的核桃WRI1-like基因（GenBank登录号：XP_018846238.1）的CDS序列，采用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列见表1。以上述cDNA为模板进行目的基因JrWRI1的PCR扩增，反应条件为：94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，54℃退火 70 s，72℃延伸 30 s，36个循环;最后 72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳，对目的基因进行回收，将目的基因与克隆表达载体pMD-19T连接，转化大肠杆菌 DH5α，目的基因菌落PCR检测，挑取3个阳性克隆菌落进行测序。

1.3JrWRI1基因生物信息学分析

通过NCBI在线BLAST（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov）工具对JrWRI1基因编码蛋白序列进行同源序列查找，采用MEIGA软件对WRI1同源序列进行序列比对及系统进化分析。运用ProtParam （http：//us.expasy.org/tools/ProtParam.html）预测JrWRI1的分子量、等电点等理化特性;通过PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/get_results？）软件预测JrWRI1的功能及亚细胞定位。

2结果与分析

2.1核桃果实种仁油脂转化期的确定

对‘香玲核桃果实的发育过程进行调查，解剖不同发育时期的果实（图1），明确‘香玲核桃种仁进入油脂转化期所需的时间（以开花后天数DPA计量）。自开花至60 DPA，果实处于快速膨大期，胚囊不断扩大，核壳逐渐形成，但色白质嫩，种仁逐渐形成透明半流质状的内含物;花后60 DPA左右，果实处于硬核期，种壳自顶端向基部逐渐硬化，种仁内含物质开始积累;自60 DPA至125 DPA，果实大小基本定型，种壳逐渐骨质化，种仁内含物快速增加，种仁风味由甜变香。可见‘香玲核桃种仁自60 DPA左右至成熟期（125 DPA）进入内含物填充阶段，也是油脂逐渐积累的阶段，属于油脂的转化期。

2.2JrWRI1基因克隆及序列分析

依据GenBank登录的核桃WRI1-like基因（GenBank登录号：XP_018846238.1）的CDS序列设计引物，以‘香玲核桃种仁cDNA为模板，通过RT-PCR技术，扩增获得转录因子JrWRI1基因，其cDNA序列全长为1 230 bp（图2），编码409个氨基酸。将扩增得到的目的基因片段进行回收并与pMD-19T质粒相连，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落送交上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与GenBank登录的核桃WRI1-like基因的序列相比对。结果如图3所示，三个阳性菌落目的基因序列完全一致，与核桃对照基因WRI1-like序列的相似度为99.92%，可见转录因子WRI1属于非常保守的基因家族，扩增得到的JrWRI1基因全长即为目的基因。

2.3JrWRI1基因家族进化关系分析

运用NCBI网站BLAST工具对核桃、桃、山杏、甜樱桃、胡杨、大豆、芝麻、拟南芥等植物中转录因子WRI1同源基因的蛋白序列进行搜索，将搜索到的WRI1序列与目的基因JrWRI1的蛋白序列构建系统发育进化树（图4）。结果显示，JrWRI1与木本植物胡杨（Populus euphratica L.）的进化关系最近，与草本植物菠菜（Spinacia oleracea L.）、南瓜[Cucurbita moschata（Duch. ex Lam.） Duch. ex Poiret]等关系较远。

2.4JrWRI1基因生物信息學分析

通过NCBI在线软件BLAST对JrWRI1基因的蛋白质序列进行分析，发现其属于AP2/ERF转录因子超级家族，在第61—133和163—227两个位置有保守的AP2结构域（图5）。通过ProtParam推测其分子式为 C1961H3065N571O628S18，相对分子质量 45 265.44，等电点6.36，JrWRI1蛋白所带总负电荷（Asp 和 Glu）为47，总正电荷（Arg和Lys）为43。运用PredictProtein对JrWRI1的功能及亚细胞定位进行预测，结果表明该蛋白具有特异的DNA结合序列，可以调节生物合成和代谢过程，其定位于细胞核中，符合转录因子行使功能的特点（图6）。

3讨论

油脂合成与积累是核桃坚果品质形成的关键，提高果实含油量对于增加核桃产量和改善品质具有重要意义。油脂合成是一个复杂的生理生化过程，在过去的50多年，人们对种子油脂合成与积累过程有了一些了解，并成功克隆了一些油脂合成相关的关键酶基因，并对其功能进行了分析，但人们对其分子调控机制的研究仍处于初级阶段，且研究对象主要集中在拟南芥及其他农作物上。近年来，有关核桃果实油脂合成代谢的研究取得一些进展，张通[11]在对山核桃果实种仁油脂合成相关基因的表达分析中发现了WRI1。张楠[12]利用转录组数据分析了核桃胚脂肪积累期脂肪代谢通路中关键基因的表达模式，为进一步研究相关基因的功能及调控机制提供了基础。陈虹等[13]运用透射电子显微镜技术观察了核桃种子油体发育过程中的超微结构，使人们对核桃油脂的积累过程有了微观的认识。然而核桃果实油脂合成与积累中的调控机理仍不清楚。本研究通过对核桃转录因子JrWRI1基因进行克隆及生物学功能分析，初步确定其在核桃生物合成及代谢过程中起重要作用，构建了JrWRI1基因原核重组表达载体，为进一步研究JrWRI1基因在核桃果实油脂合成与积累中的功能奠定基础，期望为利用分子手段加快高油核桃新品种的选育提供有益的参考。

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