孙海伟 田苍祥 张虹 孙阳阳 张攀 周波 尚涛 曹德航

摘要：本研究通过对山东茶区的20个茶树无性系品种（系）进行SRAP亲缘关系分析发现：新选育品种碧霞春与农抗早有极高的遗传相似性。引进品系毛头种，虽然由浙江地方选育，但其与乌龙茶系列品种亲缘关系较近。舒茶早、平阳特早、金萱与其它品种的亲缘关系较远，形成单独的各类。

关键词：茶树;品种（系）;亲缘关系;SRAP

中图分类号：S571.103文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）02-0018-05

Genetic Relationship Analysis of New

Tea Varieties （Lines） by SRAP Marker

Sun Haiwei  Tian Cangxiang  Zhang Hong  Sun Yangyang

Zhang Pan  Zhou Bo3， Shang Tao3， Cao Dehang3

（1.Taishan Academy of Forestry Science， Taian 271000， China; 2.Jinan Yushuchun Tea Co.， Ltd.，

Jinan 250309， China; 3.Taian Agricultural Bureau， Taian 271000， China）

AbstractThe genetic relationship of 20 tea clone varieties （lines） in Shandong tea area were analyzed by SRAP marker. It was found that the new variety Bixiachun had very high genetic similarity with Nongkangzao. The introduced line Maotouzhong was bred in Zhejiang Province， but it had close relationship with Oolong tea series varieties. Shuchazao， Pingyangtezao and JinXuan were classified in a category with distant genetic relationship with the other varieties （lines）.

KeywordsTea tree; Variety （line）; Genetic relationship; SRAP

山東省“南茶北引”先后引进福建福鼎大白种、浙江鸠坑种、安徽黄山群体种以及湖南、江苏等多地无性系品种，据不完全统计，山东茶区茶叶引进栽培品种达到75个[1，2]，其中国家级良种40个，省级良种14个，地方良种21个。虽然品种多，但主栽品种仍以鸠坑种、福鼎大白种、黄山群体种等种子苗为主，无性系良种比例不高。1997年以来，泰山林业科学研究院针对生产中引种适应性差、移栽成活率低等问题，经过实生选种、优株优系筛选、良种引进等工作，分别在泰山林业科学研究院、济南玉树春茶业有限公司基地、泰安市岱岳区山口镇建立茶树种质资源圃和优系（品种）对比园，收集国内主要茶区的茶树品种、茶优系等共计27个。通过建立山东适制绿茶品种的筛选评价指标和体系，利用最大隶属度模糊综合评价，筛选出适宜山东茶区栽培的绿茶适制品种和品系7个[3-6]，其中选育出自主知识产权的新品种1个碧霞春（罗汉3号），地方新品系1个毛头种。

SRAP标记不仅能进行遗传多样性研究，也能用于资源的分子鉴别，是研究茶树遗传多样性的有效手段[7，8]。本试验对表现优良的20个无性系茶树良种与自选品系在不同立地条件下建立品种（系）对比园，并对其亲缘关系进行SRAP分析，以期了解选育和引进茶树种质资源的亲缘关系和遗传背景。

1材料与方法

1.1试验材料

2018年6月21日在试验园分别选取20个品种（系）的一芽一叶幼嫩组织20个，编号后交由山东诺丁生物科技有限公司开展SRAP分析。具体品种编号及来源见表1。

1.2茶树品种（系）DNA提取、扩增和电泳检测

DNA提取采用CTAB法[9]，同时对提取的DNA样品分别进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测后，将提取的DNA直接在4℃保存备用或溶于100 μL TE溶液中于-20℃保存。

PCR扩增体系：反应体系为25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 3 μL，25 ng·μL-1 DNA 1 μL，5 μmol·L-1 上、下游引物各1.5 μL，5 U·μL-1 Taq酶 0.3 μL，用ddH 2O补足体积。

SRAP扩增程序：94℃预变性5 min;94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5个循环;94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒定功率 50 W 电泳 1.5 h，利用银染法进行染色，后扫描保存图片。

1.3SRAP引物  参照 Li 等[10]的引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物10组（表2，表3），对20个样品进行SRAP扩增。

1.4电泳结果统计及处理分析

根据PAGE电泳结果，凝胶相同迁移率位置上有DNA条带记为1，无DNA条带记为0，形成SRAP指纹图谱。利用POPGENE软件计算每对SRAP引物的多态性位点数和多态性位点百分率，等位基因数Na，有效等位基因数Ne，各材料间的 Neis 遗传相似系数 （GS），Neis遗传多样性指数（H）和Shannons信息指数（I），并利用 NTSYSpc version 2.10e 软件根据 Neis 遗传相似系数采用 UPGMA 方法进行聚类分析。

2结果与分析

2.120个茶树品种（系）DNA提取质量

茶叶富含多酚，一般的提取试剂盒提取完整性比较差，采用CTAB法提取的茶叶DNA条带完整，拖尾现象少，DNA没有降解，电泳结果如图1，保证了SRAP的准确性。

2.2不同引物对20个茶树品种（系）SRAP扩增效果

利用10对引物对20种检测样本DNA进行SRAP扩增，并进行PAGE电泳分析。PAGE电泳检测提高多态位点的分辨率，共扩增出256个位点，条带大小分布在40～500 bp之间，多态差异性明显，后续数据分析可靠。图2为引物组合P1的扩增结果。

2.320个茶树品种（系）的指纹图谱

指纹图谱直接反映生物个体在DNA水平上的差异，可有效鉴别茶树品种，保护品种权。为标记一下我们新选育的茶树品种碧霞春，根据各对引物组合的稳定性、多态位点百分率、有效等位位点数和其对品种的鉴别能力，筛选出3 对引物组合P1、P2、P9用于茶树品种指纹图谱的构建。将代表等位基因位点有无的1和0按顺序组成数字指纹，建立了20个茶树品种的指纹图谱（表4）。

2.420个茶树品种（系）的亲缘关系分析

利用10对引物在20个样品中获得256条扩增片段，在POPGENE软件中计算10对引物的多样性指数（表5）。20个茶样品等位基因平均数（Na）介于1.8077和1.9630之间，平均值为18919;有效等位基因数（Ne）介于1.3676和1.6707之间，平均值为1.4644;Neis遗传多样性（H）介于0.2196和0.8930之间，平均值为0.3372;Shannons信息指数（I）介于0.3427～0.5499，平均值为0.4215;多态位点最多达到31个;多态百分数介于84.85%～96.30%，平均值为89.99%。

利用数据，在NTSYS软件中计算样品间的遗传相似系数（GS值），得到供试材料遗传相似矩阵。遗传相似系数越大，表明亲缘关系越近;遗传相似系数越小，表明亲缘关系越远。由表6可以看出， 9号和10号遗传相似系数最高，达到0.9688，9号为自选碧霞春，10号为农抗早，说明两者亲缘关系很近。10号和12号间遗传相似系数最小，为0.6211，说明农抗早和舒茶早亲缘关系较远。

在遗传相似系数0.6988处，大体可以将20个品种聚为5类（图3），其中A类有8个品种，以乌龙茶系列品种为主，分别为水仙、瑞香、大红袍、本山、肉桂、梅占、黄观音、毛头种;B类有9个品种，以来自浙江、湖南、安徽的绿茶品种为主，分别为中茶102、龙井长叶、龙井43、中茶108、玉绿、碧香早、碧霞春、农抗早、劲峰，新选育品种碧霞春与农抗早亲缘关系较近;C类有1个品种，为金萱;D类有1个品种为平阳特早;E类有1个品种为舒茶早。

3讨论与结论

自选新品系碧霞春母树为 “南茶北引”时期从山东泰山樱桃园栽培的黄山群体种实生单株的杂交后代中获得，该品系有较强的抗寒性和抗病虫特性。从遗传相似系数可以看出，碧霞春和农抗早遗传相似系数达到0.9688，而农抗早来源于安徽，进一步证实碧霞春来自安徽品种群后代的可能性大;农抗早和舒茶早之间遗传相似系数最小，为0.6211，说明两品种亲缘关系较远。

试验选用的20个品种（系）大体可以聚为5类，引进品系毛头种，虽然来自浙江，但其与乌龙茶系列品种亲缘关系较近。舒茶早、平阳特早、金萱与其余品种的亲缘关系较远，形成单独的各类。金萱虽然是来自台湾的乌龙茶品种，但与试验的6个乌龙茶品种水仙、瑞香、大红袍、本山、梅占、黄观音亲缘关系较远。

山东茶树栽培历史较短，茶树良种选育工作与浙江、安徽、湖南等主产区相比起步较晚。本研究所选用的20个茶树品种（系）是在山东有较强适应性的代表品种，也有一定栽培面积，通过遗传多样性分析说明其遗传多样性水平较高，揭示其遗传变异较为丰富。这些丰富的种质资源为山东选育当家良种储备了众多优良亲本，且亲本遗传基础强大，避免了遗传背景过于单一的问题。

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