吴佳璟，朱文妍，孙亦农，朱世鹏

逆针灸是针灸的一种，“逆”指未至而迎之，属于针灸中的“未病先防”，是指在疾病还未发生或是即将要发生之前预先予以针刺治疗，激发经络之气以预防疾病的发生或者减轻疾病的程度。肥胖是多种疾病如糖尿病、心血管疾病、癌症等的危险因素，对于肥胖的预防和治疗一直是临床研究热点和难点。大量研究证实针灸在肥胖的治疗上有独特的优势［1］，然而逆针灸对肥胖是否有预防作用及其可能的相关机制尚未可知。本研究拟通过观察逆针“丰隆穴”对大鼠肥胖、瘦素抵抗以及脂肪组织中转录因子过氧化物酶体增值物激活受体γ（PPAR-γ）水平的影响，探讨逆针灸防治肥胖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 实验时间：2016年5—7月。4周龄SPF级雄性大鼠24只，体质量110～120 g，由南京中医药大学实验动物中心提供，随机分为模型组、逆针组和空白组，每组8只。明暗周期12 h，自由饮食和饮水，环境温度24 ℃，湿度40%～50%，普通饲料适应性饲养7 d后，模型组和逆针组进行高脂饲料喂养，空白组进行普通饲料喂养，为期12周（全部饲料由江苏省协同生物有限公司提供）。以大鼠体质量超过空白组20%为肥胖标准。实验过程遵循南京中医药大学实验动物伦理委员会要求进行。

1.2 主要仪器与试剂 台式普通离心机以及台式低温冷冻离心机（Eppendorf公司），实时荧光定量PCR仪器（Applied Biosystems公司），多功能酶标仪（瑞士TECAN公司），组织匀浆机（上海净信科技有限公司），光学显微镜（OLYMPUS公司），ELISA试剂盒（南京拓轮生物科技有限公司），IP细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），qPCR Mix（南京诺唯赞生物科技有限公司），引物订购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 干预方法 将逆针组大鼠固定在自制固定器上，待大鼠平静后，用碘伏消毒双侧“丰隆”穴区域，使用一次性一寸长针灸针，手持柄垂直进针，进针深度7 mm，留针20 min。干预在造模开始的同时进行，每周干预3次，持续进行12周。空白组和模型组同步抓取固定，不干预。

本研究创新点：

首次观察了逆针灸对于高脂饮食诱导大鼠肥胖的预防作用，并从分子角度揭示了逆针灸对肥胖预防的机制，可能与其使机体对瘦素的敏感性升高，同时减少能量摄取，促进脂肪分解有关，且对预防肥胖有一定价值。

本研究局限性：

本研究观察周期较短，逆针灸对肥胖的预防是否具有长时间的持续作用，有待进一步观察。此外，今后研究应进一步关注不同的针刺刺激量产生的效应是否存在差异。

1.4 取材及检测指标

1.4.1 体质量 干预期间每周测量并记录各组大鼠的体质量。

1.4.2 标本采集 10%水合氯醛麻醉后，采用腹主动脉采血法每只取血 5 ml，3 000 r/min 离心 15 min（离心半径 16 cm），分离血清，分装后置于-80 ℃冰箱中保存备用。之后迅速分离肾周脂肪组织称重，将部分肾周脂肪组织置于10%甲醛固定液中固定，剩余脂肪组织用液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中待测。

1.4.3 脂肪细胞形态学观察 将固定于10%甲醛固定液中的脂肪组织用石蜡包埋切片，并做常规HE染色。于20倍光学显微镜下观察脂肪细胞形态。然后用Image-ProPlus 6.0软件分析脂肪细胞面积图片，每组切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件，使用不规则选图工具，每张照片中随机圈出5个脂肪细胞，测出单个脂肪细胞面积，并求出每张切片中脂肪细胞的平均面积。

1.4.4 ELISA法检测血清瘦素水平 取出-80 ℃冰箱中保存的血清，按照ELISA试剂盒中产品说明书上的步骤进行检测。

1.4.5 qPCR检测脂肪组织中转录因子PPAR-γ水平 每组随机选择3个脂肪样本分别称取脂肪组织100 mg，按步骤进行RNA的提取，用BioPhotometer生物分光光度计检测提取的RNA样品浓度及纯度，取1 μg RNA 为模板，按照日本TOYOBO 公司的 ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒说明书的操作步骤进行反转录成cDNA，反应体系：5×RT Buffer 4 μl，Primer Mix 1 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，RNA 1 μg，DEPC Water 20 μl。反转录条件：37 ℃ 20 min，40 个周期；98 ℃ 5 min，40个周期。qPCR按照南京诺维赞公司的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 产品说明书进行，引物序列见表1，之后放在ABI qPCR仪上进行反应，结果由ABI qPCR仪相应的 Step One Software v2.1 软件分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量 干预前、干预第4周3组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。干预第8周，3组大鼠体质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中模型组大鼠体质量高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预第12周，3组大鼠体质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中模型组、逆针组大鼠体质量高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；逆针组大鼠体质量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.2 肾周脂肪组织重量 3组大鼠肾周脂肪组织重量比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。模型组、逆针组大鼠肾周脂肪组织重量大于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；逆针组大鼠肾周脂肪重量小于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.3 脂肪细胞形态学 模型组大鼠脂肪细胞面积较空白组大鼠明显增大，细胞壁较薄，细胞大小不均匀，新生脂肪细胞较多。逆针组大鼠脂肪细胞较模型组明显面积减小，细胞大小较为均匀，新生脂肪细胞较小，但是较空白组脂肪细胞面积仍略大。3组大鼠脂肪细胞平均面积比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠脂肪细胞平均面积大于空白组、逆针组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1、表4）。

2.4 血清瘦素水平 3组大鼠血清瘦素水平比较，差异有统计学意义（P=0.013）。模型组大鼠血清瘦素水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01）；逆针组大鼠血清瘦素水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01，见表5）。

2.5 脂肪组织中转录因子PPAR-γ表达水平 3组大鼠脂肪组织中转录因子PPAR-γ表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠脂肪组织中转录因子PPAR-γ表达水平高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；逆针组大鼠脂肪组织中转录因子PPAR-γ表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表6）。

3 讨论

大量研究已证实，针灸在机体多种疾病状态下有较为显著的治疗作用，其对肥胖的治疗效果也较为明确［1-3］。而随着医学关注对象逐渐从“已病”转向“未病”，逆针灸“治未病”的预防思想越来越被重视，而逆针灸也被证实可以预防多种疾病状态［4］。本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠体质量显著升高、肾周脂肪组织重量显著增加、脂肪细胞面积明显增大，新生脂肪细胞较多，说明高脂饮食造成了大鼠的肥胖以及脂肪异常堆积状态。与模型组相比，干预第8周时逆针“丰隆”穴对体质量的影响还没有明显效果；干预第12周时，逆针组体质量较模型组明显降低，说明逆针“丰隆”穴针刺效应积累到一定程度，可以显著改善高脂饮食引起的体质量增加。12周干预结束后，逆针组大鼠的肾周脂肪组织重量较模型组减少，与此同时，逆针“丰隆”穴还能明显改善脂肪细胞的病理形态，缩小脂肪细胞的体积，抑制脂肪细胞的新生。因此，逆针“丰隆”穴可能通过促进内脏脂肪的分解、改善脂肪的分布和异常堆积、恢复脂肪细胞正常形态来减预防和延缓肥胖的发生发展，其效应的发挥需要一定程度的针刺刺激量积累。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequences for PPAR-γ andβ-actin

表2 3组大鼠不同时间体质量比较（x±s，g）Table 2 Comparison of the body weight between 3 groups of rats before intervention，and at the end of the 4th，8th and 12th weeks of intervention

表3 3组大鼠肾周脂肪组织重量比较（x±s，g）Table 3 Comparison of the perirenal fat weight in 3 groups of rats

图1 3组大鼠脂肪细胞形态学（HE染色，×200）Figure 1 Morphology of adipocytes in 3 groups of rats

表4 3组大鼠脂肪细胞平均面积比较（x±s，mm2）Table 4 Comparison of the average area of adipocytes in 3 groups of rats

表5 3组大鼠血清瘦素水平比较（x±s，ng/ml）Table 5 Comparison of the serum leptin level between 3 groups of rats

表6 3组大鼠脂肪组织中转录因子PPAR-γ表达水平比较（n=3，x±s）Table 6 Comparison of the expression level of PPAR-γ in the adipose tissue in 3 groups of rats

瘦素是由脂肪细胞分泌的一种脂肪组织源激素，作用于大脑特别是下丘脑的传入信号，通过调节食物摄取和能量消耗来协调能量平衡［5］。瘦素不仅可以抑制食欲，增加能量的消耗，还可以抑制脂肪的合成，从而调控脂肪的沉积。研究发现大多数肥胖机体体内并不缺少瘦素，并且血瘦素含量与BMI呈正相关，说明机体对瘦素的反应减弱，称为瘦素抵抗［6］。大多数高脂饮食会引起血液中瘦素水平升高［6-7］，高瘦素血症引起的瘦素向大脑转运减少是瘦素抵抗发展的关键因素［8］。本研究结果显示，模型组血清瘦素水平高于空白组，说明高脂饮食造成大鼠肥胖状态的同时，升高了血清瘦素水平，出现瘦素抵抗。既往研究发现，在机体存在瘦素抵抗时，常会伴有脂肪细胞数量增多、体积增大，导致脂肪的异常堆积［9］。本研究细胞形态学观察结果也符合这一表现。在机体瘦素抵抗状态下，补充瘦素并不能治疗肥胖［10］。因此，如何改善瘦素抵抗，是研究关注的重点之一。研究发现，针灸作为治疗肥胖的有效疗法，在改善瘦素抵抗方面具有一定的作用。如有研究认为针灸可以降低肥胖大鼠血清瘦素水平，增加下丘脑瘦素受体水平，调节肥胖机体血清高瘦素状态，改善肥胖大鼠的瘦素抵抗状态［11］；而逆针灸可以改善大鼠更年期瘦素抵抗，从而预防和延缓更年期的卵巢功能减退和脂肪异常堆积［12］。最新研究发现，与口服抑制食欲药物、饮食疗法或者锻炼相比，针灸可以更显著地改善肥胖患者的瘦素抵抗［13］。本研究首次观察了逆针“丰隆”穴对高脂饮食大鼠瘦素抵抗的影响，结果显示：经过逆针“丰隆”穴预防性治疗后，大鼠血清瘦素水平较模型组大鼠明显降低，说明逆针“丰隆”穴可以缓解血清高瘦素状态，改善高脂饮食诱导的瘦素抵抗。

PPARs最初由英国科学家ISSEMANN等［14］于1990年首次发现，可分为α、β、γ 3种亚型［15］。PPAR-γ主要在脂肪组织中表达，是脂肪细胞分化和代谢的关键调节因子，其不仅能够调控脂肪细胞的分化、增加脂肪细胞的数量，还能调控脂肪细胞相关基因的表达，从而参与脂肪代谢、影响脂肪细胞的分泌［16］。因此PPAR-γ与肥胖的发生和发展密切相关。CHEN等［17］研究发现，高脂饮食可引起大鼠肝脏PPAR-γ表达水平升高；LESTARI等［18］的研究证实，高脂饮食可引大鼠内脏脂肪组织PPAR-γ表达水平增高。本研究结果显示，模型组脂肪组织中转录因子PPAR-γ水平高于空白组，表明高脂饮食造成了大鼠内脏脂肪PPAR-γ表达的上调，与相关研究结果一致［18］。基于PPAR-γ促进脂肪生成的作用，既往研究证实通过抑制PPAR-γ可以治疗肥胖［19］。本研究结果显示：逆针组大鼠脂肪组织中转录因子PPAR-γ水平低于模型组，表明逆针“丰隆”穴可以降低高脂饮食大鼠脂肪组织中PPAR-γ的表达，推测这一调节作用可能是逆针“丰隆”穴可以减少脂肪合成，抑制脂肪分化，最终恢复其正常代谢的重要途径。

综上，逆针“丰隆”穴使大鼠对瘦素的敏感性升高，对下丘脑摄食中枢产生作用，减少能量的摄取，促进脂肪分解，是其预防肥胖的重要途径之一。逆针“丰隆”穴可以有效预防高脂饮食诱导大鼠的脂肪代谢异常，其机制可能与改善瘦素抵抗及调节脂肪组织中转录因子PPAR-γ的表达有关。

作者贡献：朱世鹏进行研究的设计与实施，文章审校；吴佳璟撰写论文；吴佳璟、朱文妍进行研究实施、评估、资料收集；孙亦农进行质量控制。

本文无利益冲突。