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(石河子大学食品学院,新疆石河子 832000)

沙枣花为胡颓科植物沙枣(ElaeagnusangustifoliaL.)的花。沙枣主要分布在西北干旱地区,新疆沙枣属于地中海地区沙枣的后代,是现代胡杨、灰杨和白榆等群落的伴生植物[1-2]。新疆沙枣花期大致在5月份,南疆地区5月中上旬开花,北疆地区5月下旬开花,花期20 d左右,因品种、气温不同,而略有差异[3-5]。沙枣花能够释放独特的香气物质,具有“飘香沙漠的桂花”的美称[5-7]。对沙枣花芳香成分的分析已有许多报道,主要集中在沙枣花精油的提取工艺上,对于特征香气分析的研究较少。研究新疆沙枣花特征香气成分,分析不同工艺、不同地区沙枣花的香气差异,对研究呈香机理有一定的贡献作用。

固相微萃取(Solid phase micro-extraction,SPME)是一种新型样品预处理富集技术,广泛应用于环境、药物及各种食品风味的分析检测中[8]。气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)作为分析挥发性风味物质的有效方法,已广泛应用于食品风味、香精香料及调味品的挥发性风味物质分析[9]。气相色谱-嗅闻技术(gas chromatography-olfactometry,GC-O)技术以人鼻作为感受检测器,能够快速准确的发现植物特征香气的构成,并根据各香气成分的气味强度对总体香气的贡献进行排序[10]。主成分分析(principal component analysis,PCA)是将研究对象的复杂多指标问题通过特定方式的数据转换,同时提供多变量整体化、数据变异方向、群点散布、数据点分布等信息,最终转化为简单且较少数量综合指标的一种统计方法[11-14],可运用于对品种来源、植物香气、加工工艺、分布区域进行分类及类别归属的判别,及在不遗漏重要信息的情况下分析鉴别影响样本差异的关键变量。乔海军等[4]利用水蒸气蒸馏法提取沙枣花挥发油,采用GC-MS对其化学成分分离鉴定,结果鉴定出57种化合物可有效评价甘肃沙枣花的整体风味。经研究沙枣花挥发性香气成分,主要成分为肉桂酸乙酯,还包括一些醛醇及杂环类物质。但到目前为止,对沙枣花的研究仍停留在挥发性物质的分析上,为了确定沙枣花特征香气的主要贡献物质及准确有效的评价和监控沙枣花产品,本研究以沙枣花为研究对象,采用5种不同方法对沙枣花挥发性香味物质进行提取,利用GC-MS对沙枣花挥发性成分进行定性定量分析、GC-O分离鉴定沙枣花挥发性香气活性成分、结合主成分分析、香气强度及感官评价确定其中特征香气成分及相关性,为沙枣花的深度开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙枣花 2016年5月下旬采摘于新疆石河子市145团,属于地中海沙枣的后代;正构烷烃混合样本(C6～C26) 购自上海国药集团化学试剂有限公司;其它试剂均为分析纯 购自国药集团化学试剂有限公司。

超临界CO2萃取装置 美国SepTech公司;Clarus 500;SPME萃取装置 美国Supelco公司,75 μm CAR/PDMS;旋转蒸发仪(RE52-98) 上海亚荣生化仪器厂;6890气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司,Supelco18275-06APTE-5Capillary柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);6890气相色谱-嗅闻仪(GC-O) 美国Agilent公司；ODP2嗅闻端口 德国GERSTEL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 水蒸气蒸馏法:准确称取100 g自然阴干的沙枣花,置于1000 mL圆底烧瓶,按1∶5的比例加入蒸馏水进行蒸馏,馏出液采用分析纯二氯甲烷萃取,萃取液用无水硫酸钠干燥24 h后过滤,将滤液通过旋转蒸发仪旋蒸浓缩,收集二氯甲烷溶剂,得到具有独特芳香气味的淡黄色液体即为沙枣花挥发油。放入4 ℃冰箱保存,尽快检测。

索氏提取法:采用索氏提取器,准确称取10 g磨碎的自然阴干的沙枣花,放入滤纸筒封口,置于索氏提取器,样品高度接近虹吸管,平底烧瓶注入2/3体积的无水乙醇,置于45 ℃水浴锅中进行回流,反复抽提2～3 h,至颜色变淡黄为止,再旋转蒸发得到沙枣花挥发油,放入冰箱,尽快检测。

真空泵抽取吸附采集法:将装有Tenax TA的采样管一端与空气采样泵连接,另一端深入保鲜袋中的沙枣花当中。启动泵,空转速率3 L/min,采样时速率2 L/min,采集30 min使得沙枣花挥发性香气物质吸附于Tenax TA填料上[14]。采集过程中不时翻动保鲜袋,使得挥发性香气物质在保鲜袋中混合均匀。采集完毕后将采样管密封包装,两天内采用热解析仪和气质连用仪对香气成分进行分析。

固相微萃取:取自然阴干的沙枣花100 g,放入200 mL锥形瓶中,用封口胶将瓶口密封,固相微萃取器在采样前先进行老化(将萃取器针头插入GC-MS进样口中,进行250 ℃高温热解老化30 min[15])。将老化后的萃取器针头插入密封的盛有沙枣花的锥形瓶,在250 ℃下萃取40 min后立即拔出萃取剂针头,插入GC-MS进样口进行分析[16]。对液体样品:称取2 g氯化钠加入20 mL顶空瓶中准确量取2 mL液体样品加入顶空瓶中,然后加入磁力搅拌转子,加盖密封,将SPME针管穿透样品瓶隔垫,调整插入长度,水浴45 ℃搅拌平衡15 min,45 ℃水浴条件下萃取吸附30 min取出手柄,直接进样,250 ℃温度条件下解吸3 min,每个样品重复3次[16,18]。

超临界CO2萃取:准确称取100 g自然阴干的沙枣花装入1 L的超临界CO2萃取釜中进行萃取。萃取温度45 ℃、萃取压力24.83 MPa、萃取时间1 h。收集萃取的沙枣花挥发油,放入冰箱保存,尽快检测[7]。

1.2.2 检测条件 色谱条件:色谱柱为Supelco18275-06APTE-5Capillary柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);柱流量(恒流)0.8 mL/min;进样口温度250 ℃;进样量为1 μL;分流比为20∶1;氮气为载气;采用程序升温,初始温度为60 ℃,然后以2 ℃/min的速率升到180 ℃,再以15 ℃/min的速率升到290 ℃(保持15 min)[19]。质谱条件:质谱的质量检测范围为29～420 aum;电子倍增电压(EMV)为1435 V;电离电压为70 eV;离子源温度为230 ℃;四级杆温度为150 ℃。

1.2.3 GC-O分析条件 除索氏提取法外其余4种方法提取出的样品平衡30 min后进行分析,以合成干燥空气为载体,流速200 mL/min;顶空参数:时间10 min,温度50 ℃,搅动速度250 r/min;顶空注射参数:注射体积2500 μL,注射速度600 μL/s,注射温度50 ℃,最后数据获取时间180 s[20]。

1.2.4 感官评定 采用SPME提取沙枣花样品中的挥发性成分。经GC-MS检测,流出物在毛细管末端以1∶1的分流比流入嗅闻仪。嗅闻端口由8名经过提前培训的感官评价员进行嗅闻评定实验。本次实验采用检测频率法分析不同提取条件下沙枣花特征香气活性物质,即8名感官评价员对分析样品中特定保留时间上的香气成分香味呈现与否进行感官评定并记录相应比率[21]。评价员检测出频率最高的香气成分,对样品风味影响最大。感官评定是研究香味物质评定项目不可或缺的部分。评价小组由经验丰富、无吸烟史,年龄25～45岁的4名男性和4名女性评定人员组成,并按照标准培训。所有感官实验都在特定的感官评定室进行,每个样品重复评价。评分方式采用10分制,0～2分,似有似无;2～4分,较弱;4～6分,中等;6～8分,较强;8～10分,非常强[22]。

1.3 数据分析

实验数据处理由GC自带Xcalibur软件系统处理,将所测得各挥发物的谱图与NIST2008和Wiley9谱库中标准物质的谱图比对,匹配度大于80%予以记录。相似度分析采用Excel 2003软件分析,聚类分析用于构建沙枣花特征香味物质样本的筛选,主成分分析(PCA)用于对沙枣花和模拟沙枣花产品质量的监控,所有数据均进行3次平行试验。RI:保留指数,气相色谱定性指标参数。

2 结果与分析

2.1 不同提取工艺沙枣花挥发性物质GC-MS分析

为了建立能够有效识别沙枣花特征香味的指纹图谱,依据5种不同提取工艺及GC-MS测定的沙枣花样本进行挥发性物质分析,结果如图1。

图1 各法提取沙枣花挥发性香味物质GC-MS图谱Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds in flowers of E.angustifolia by different extraction注:a:水蒸气蒸馏法,b:索氏提取法,c:真空泵抽取吸附法,d:固相微萃取法,e:超临界萃取法。

如图1a所示,水蒸气蒸馏提取法,从基峰、相对峰度等方面进行比较,共鉴定出46种化合物,用峰面积归一法确定各组分相对含量,主要成分为2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、正己烷、甲基环戊烷、环己烷、反式-肉桂酸乙酯。挥发性化合物主要以醇、酯、醛、酮、酸、烷烃类为主,其中酯类物质5种,醇类物质10种,酸类物质8种,醛类物质4种,酮类物质3种,烃类物质9种,酚类物质4种,其它物质3种。

图1b索氏提取法提取的沙枣花挥发物中含38种化合物,其中酯类最多17种,醇类物质5种,酸类物质5种,醛类、酮类各2种,烃类物质3种,酚类物质3种,其它物质1种。含量最多的物质为反式-肉桂酸乙酯(43.33%)、二十烷基苯甲酸酯(8.88%)、2,3-丁二醇(6.21%)。

图1c真空泵抽取吸附采集法提取的沙枣花挥发物中共检测到69种化合物,其中检测出酯类物质24种,醇类物质14种,醛类物质4种,酸类物质6种,酮类物质1种,苯环类物质5种,烃类物质6种,苯环类物质6种,其它物质3种。在5.5 min开始出峰,39.2 min出现最高峰,40.6 min出峰结束。其中含量比较高的物质是反式-肉桂酸乙酯(12.8%)、乙酸乙酯(7.7%)、2-甲基丁酸乙酯(7%)。

图1d固相微萃取法提取的沙枣花挥发物质中检测到36种化合物,其中烃类5种,酯类物质16种,醇类物质6种,醛类物质5种,酮类物质1种,其它物质3种。在1.48 min开始出峰,在26.43 min出现最高峰,44.34 min出峰结束。其中含量较高的物质有反式-肉桂酸乙酯(69.35%)、肉桂酸甲酯(17.32%)、苯乙烯(7.24%)。

图1e超临界CO2萃取法提取的沙枣花挥发物中共检测到34种化合物,其中烃类物质5种,酯类物质18种,醇类物质5种,酸类物质3种,醛酮类物质各1种,其它物质 1种。在5.45 min开始出峰,在24.12 min出现最高峰,在40.47 min出峰结束。其中含量较高的物质有反式-肉桂酸乙酯(23.55%)、肉桂酸乙酯(10.48%)、肉桂酸甲酯(9.34%)。

2.2 不同提取工艺沙枣花特征香味物质聚类分析

由于提取方法的不同,其香气组成与含量亦存在相应的差异,沙枣花采集时间不同,也会影响香味成分及特征香气的筛选[23]。为了得到较为准确的特征香气成分,本研究选用5种不同提取方法,按照GC-MS分析条件对其活性香味物质进行分析测试,将各色谱峰的峰面积与样品号建立矩阵,剔除差异较大样品[23]。聚类分析结果用树状图表示,其中1、2、3、4、5分别代表水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法、真空泵抽取吸附采样法、固相微萃取法、超临界萃取法所提取的挥发性物质。

由图2可知,1和3在最小距离水平上形成聚类,4和5在最小距离水平上形成聚类,因此,1和3之间具有最大相似性,4和5之间具有最大相似性。欧式距离增大到13左右时前两个聚类合为一个大的聚类。随着欧式距离的增大,当增至25.0时,2也并入其中。说明2与其余4之间相似度明显较低,如果将其并入后续信息计算中可能对计算结果产生一定的影响。因此,将2剔除,选取1、3、4、5进行GC-O及后面主成分分析等实验。

图2 沙枣花挥发性物质聚类分析Fig.2 Cluster pedigree diagram of active-volatile in flowers of E.angustifolia

2.3 沙枣花香味活性物质GC-O分析

采用GC-O技术嗅闻技术,对沙枣花挥发性物质进行分析,结果如表1。

表1 4种提取工艺下沙枣花挥发性香气物质的含量和风味特征描述Table 1 The contents and flavor characteristics of aroma compounds in flowers of E.angustifolia by 4 extracted methods

续表

由表1可知,经3次重复试验,4种方法提取沙枣花挥发物质种共鉴别出63种香味活性的物质,其中共有物质18种,其中醛类5种,酯类6种,酮类2种,醇类2种,酚类2种,烯1种,分别是叶醛、苏合香烯、苯甲醛、己酸乙酯、辛醛、苯乙醛、苯乙酮、壬醛、苯乙醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、胡椒酚、丁香酚、肉桂酸甲酯、癸酸乙酯、反式肉桂酸乙酯、反式橙花醇、植酮。在所有挥发性香气物质种具有明显香气特征的物质包括反式肉桂酸乙酯(蜜甜香气)、肉桂酸甲酯(蜜甜香气)、胡椒酚(辛香)、苯乙酸乙酯(花香甜香)、苏合香烯(帖烯木香花香)、苯甲醛(苦杏仁香)可初步判定这些物质是沙枣花特征香气物质的重要组成部分。通过GC-O分析可知酯类物质,尤其是反式肉桂酸乙酯对沙枣花整体香气贡献最高。因此,沙枣花的主要香气特征为蜜甜香、花香、甜香、青草香、杏仁香及帖烯木香。由图3可知沙枣花中酯类香气强度值最大,主要呈现芳香,果香,对沙枣花整体香气贡献较大,醛类物质香气强度较大,是沙枣花香气的重要组成部分。

图3 不同提取方法提取的沙枣花挥发性香气物质香气强度比较Fig.3 Intensity of flavor compnents in E.angustifolia by different extraction technology

2.4 不同方法提取条件下沙枣花香气感官评价

感官评定人员对四种不同方法提取的沙枣花香气特点进行分析,感官评定由图4可知,沙枣花香气属性被描述为芳香味、果香、谷香、木香、甜香、坚果香、青香,与GC-O分析结果一致。

图4 沙枣花香味物质人工感官评价雷达图Fig.4 Radar profiles of flavoring substance in flowers ofE.angustifolia by sensory evaluation

不同方法提取条件下提取的沙枣花挥发性香气之间在感官属性方面存在一定差异。水蒸气蒸馏法提取的沙枣花挥发油中谷香和木香的评分高于其他样品,且整体香气轮廓感官属性强度最高。香甜味的整体评分都很高,且评分最高,说明香甜味最浓郁。

采用多重方差分析得到沙枣花挥发性物质在不同感官属性上的差异[24],分析结果见表2。

表2 沙枣花样品感官评定结果Table 2 Sensory evaluation results in flowers of E.angustifolia samples

由表2可知,沙枣花香气不同提取方法在甜香上无法相互区分,沙枣花感官属性中甜香分数最高,代表沙枣花在该属性上具有较高的风味强度。方差分析表明四个不同品种之间沙枣花香气属性中整体香气、木香、果香、谷香、青香均存在显著性差异(p<0.05)。感官属性中芳香、果香、甜香，作为沙枣花主体香气较为突出,表示沙枣花香气整体风味怡人。

2.5 不同工艺提取的沙枣花挥发性成分主成分分析

主成分个数提取原则为主成分对应的特征值大于1的前m个值,由图5A可知,通过方差分解主成分提取分析可知,提取2个主成分,即m=2。用主成分载荷矩阵中的数据除以主成分相对应的特征值开平方根得到两个主成分中每个指标所对应的系数。将得到的特征向量与标准化的数据相乘即可得出主成分的表达式。根据主成分综合模型可算出综合主成分值。图5B所示,PC1(57.7%)、PC2(39.8%)累计方差贡献率为97.5%,能反映不同提取工艺沙枣花挥发油样品的整体信息,可通过在平面上显示的各个图谱的分布情况,达到对样品进行识别的目的。图5C可知,新疆地区沙枣花不同提取工艺提取的挥发油样本在二维(PC1-PC2)空间投影中存在显著差异,其中固相微萃取与超临界萃取位于y轴左侧,而真空泵抽取吸附采集和水蒸气蒸馏位于y轴右侧,因此不同工艺提取的沙枣花挥发油其挥发性成分存在一定的差异;4种不同工艺条件提取的沙枣花挥发性成分样品聚集在不同象限,表明沙枣花挥发性成分不同工艺之间具有“相似性”又有“差异性”。

图5 不同提取方法提取的沙枣花挥发性物质的GC-O检测PCA图Fig.5 PCA plots of different extraction in flowers of E.angustifolia by GC-O

由表3可知,沙枣花特征香气的主要成分为反式-肉桂酸乙酯(甜蜜香气)为第一主成分,约占特征香气成分的65%～70%,其次苯乙醛(果香、花香)为第二主成分、苯甲醛(苦杏仁香)、肉桂酸甲酯(蜜甜香气)、苯乙酸乙酯(花香、甜香)、苯乙醇(玫瑰花香)、苯乙烯(帖烯木香、花香)在GC-MS和GC-O中均有检测到且相对含量较高,初步确定为沙枣花特征香气的主要成分。

表3 沙枣花香气成分综合主成分值Table 3 Synthetic principal score of aroma components in flowers of E.angustifolia

3 结论

采用SPME-GC-MS、GC-O技术,以及感官评价、主成分分析方法,对沙枣花样品的风味物质和风味属性进行较全面分析,并确定了沙枣花挥发性风味物质共有63种,包括醇类、酯类、酸类、醛类和酚类等,不同工艺之间香气物质种类和相对含量具有一定的差异,都具有各自的特点。其中超临界萃取法经检测酯类物质总量最高,如苯乙酸乙酯、肉桂酸甲酯、桂酸异丙酯等,其中反式肉桂酸乙酯在正常范围内。水蒸汽蒸馏法提取的沙枣花挥发性物质中检测到反式-肉桂酸乙酯含量占42.13%,酯类物质占总挥发性物质含量的52%;真空泵抽取吸附法提取的沙枣花挥发物中检测到反式-肉桂酸乙酯含量占总挥发性物质的12.8%,酯类物质占总挥发性物质的62.5%;固相微萃取所得反式-肉桂酸乙酯含量最高,约占总量的63.35%,总酯类物质占总挥发性物质的62%。超临界萃取检测出其中反式-肉桂酸乙酯占23.55%,酯类物质占55.44%。

针对沙枣花特征香气通过GC-MS与GC-O技术结合PCA数据分析手段建立了能够真实反映沙枣花特征的指纹图谱,用于检测沙枣花产品的真假及质量。

新疆沙枣花挥发性香气物质中肉桂酸乙酯含量较高,可作为提取肉桂酸乙酯的天然产物原料。沙枣花特征香气的筛选,为工业开发沙枣花香精与沙枣花香水等相关产品提供了理论依据。本研究数据和分析可为今后的开发与利用提供参考。