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(1.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室,贵州贵阳 550001; 2.贵州师范大学分析测试中心,贵州贵阳 550001; 3.贵阳市第三实验中学,贵州贵阳 550001; 4.喀斯特地区生物与信息技术协同创新中心,贵州贵阳 550001)

食用玫瑰是一种药食同源植物,隶属蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(RosaL.),研究表明其含挥发油、黄酮类、多酚等多种化学成分[1],具有较强抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等功效[2],对心血管和神经系统等均具有保护作用。食用玫瑰主要活性成分除挥发油中的单萜类外[3],其类黄酮成分芦丁、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有抗氧化、抗血小板活化因子等作用[4],金丝桃苷和槲皮素具有抗肿瘤、止痛和免疫调节等作用;酚酸类成分绿原酸具有抗菌、抗炎、降血糖等功能[5-6],均与其药理活性相符。

目前,食用玫瑰开发多集中在其挥发性成分提取,而中国药典[7]仅以浸出物测定为玫瑰质量控制标准,部分文献虽有关于类黄酮化合物含量的研究[8-11],但存在指标单一,控制方法简单等局限性。而多指标的质量控制模式需要对照品的种类和数量均较大,且部分对照品价格昂贵时,一测多评法的多指标模式以样品中对照品廉价易得的常见成分为内标,建立该成分与其他成分间的相对校正因子,在通过校正因子计算出其他成分的含量。试验中可在只有一个对照品而其余对照品不足的情况下,实现这些成分的同步含量测定。该方法已成功应用于当佐、丹参注射液、速效救心丸、双青咽喉片、双黄连口服液等中药的质量监控[12-16],其中黄连药材的一测多评法被2010年版中国药典采用[7]。为体现食用玫瑰多成分、多层次和多靶点的特点,充分利用植物资源提升食用和药用价值,参考相关文献[17-22],芦丁由外部标准来确定食用玫瑰中芦丁的含量,使用直接进行校准,同时作为内部标准确定其他四个物质即金丝桃苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素和绿原酸的相对校正因子。在本试验中采用外标法进行测定样品中芦丁的量,测定样品中芦丁的量后根据样品中芦丁的量、相对校正因子以及其他组分的峰面积进行计算得出样品中其他成分的量。

本研究以芦丁为内参物,建立并验证一测多评法同时计算食用玫瑰中芦丁、金丝桃苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素和绿原酸5个非挥发性成分含量可行性,为建立食用玫瑰质量标准和品质监管提供数据和方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦丁(批号:0080-9504)、槲皮素(批号:100081-200406)、金丝桃苷(批号:111521-200303)绿原酸(批号:110753-200212) 中国药品生物制品检定所;芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(批号:wkq16080705) 四川省维克奇生物科技有限公司;甲醇(≥99.9%)、乙腈 色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司;磷酸 含量≥85.0%,成都市科龙化工试剂厂;其他试剂 均为分析纯;水 自制超纯水;食用玫瑰 2017年产约含77%水份的新鲜重瓣红玫瑰花苞,由位于贵州省贵阳市惠水县玫瑰种植基地提供。

Agilent 1100系统高效液相色谱仪,配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器、Agilent色谱工作站 安捷伦科技有限公司;AL-204电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;CH-250超声波清洗机 北京创新德超声电子研究所;移液枪(量程为20～200 μL和100～1000 μL 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷对照品适量,用甲醇制成质量浓度分别为0.9400、0.8200、0.9800、1.1600、0.9600 mg·mL-1的10 mL对照品储备液。精密移取适量对照品储备液,将对照品储备液用甲醇分别稀释成槲皮素质量浓度为0.0118 mg·mL-1、芦丁质量浓度为0.1804 mg·mL-1、绿原酸质量浓度为0.1862 mg·mL-1、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷质量浓度为0.2320 mg·mL-1、金丝桃苷质量浓度为0.3600 mg·mL-1混合对照品溶液。

1.2.2 样品溶液的制备 取食用玫瑰适量,粉碎,过20目筛,精确称取5.0 g粉末,置具塞锥形瓶中,加入70%甲醇10.0 mL,称定质量,使用输出功率300 W,工作频率40 kHz的超声波清洗机超声30 min,室温下放冷,用70%甲醇补足缺失的质量数,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得待测样品。

1.2.3 色谱条件 色谱柱(Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm));流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0～8 min,10%～15% A;8～12 min,15%～17% A;12～12.1 min,17%～21% A;12.1～26 min,21%～23% A;26～47 min,23%～57% A);体积流量1.0 mL·min-1;检测波长354 nm;柱温 35 ℃;进样量10 μL。

1.2.4 线性关系考察 吸取“1.2.1”项下混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL,注入液相色谱仪。以峰面积为纵坐标(Y),进样量为横坐标(X)进行线性回归,分别得到槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷的线性回归。

1.2.5 精密度试验 精密吸取“1.2.1”项下混合对照品溶液10 μL,在“1.2.3”项色谱条件下连续进样6次,测得槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积,通过计算RSD以考察仪器的精密度。

1.2.6 重复性试验 取同一份样品,按“1.2.2”项下方法平行制备6份样品溶液,在“1.2.3”项色谱条件下测定槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积,通过计算RSD以考察实验的重复性。

②获得多重随机森林中每一个子随机森林模型对测试数据集D的预测率,将所有预测结果放入以整型数为K值,以预测率为V的Map集合中,如下所示:

1.2.7 稳定性试验 精密吸取“1.2.2”项下同一样品溶液各10 μL,在“1.2.3”项色谱条件下于0、4、8、12、16、20、24 h进样,测定槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积,通过计算RSD以考察样品的稳定性。

1.2.8 加样回收率试验 精密称取含有已知量的样品6份,每份2.5000 g,置具塞的50 mL锥形瓶中,分别加入一定量的“1.2.1”项下0.940 mg·mL-1槲皮素、0.820 mg·mL-1芦丁、0.980 mg·mL-1绿原酸、1.160 mg·mL-1芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、0.960 mg·mL-1金丝桃苷对照品储备液,按“1.2.2”项下方法制备各样品溶液,在“1.2.3”项色谱条件下测定。

1.2.9 样品含量的测定 按“1.2.2”项下方法制备6批样品溶液,平行3份,分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液10 μL,进样测定,记录槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷的峰面积。在本试验中采用外标法测定样品中芦丁的量，测定完样品中芦丁的量之后，再根据样品中芦丁的量、相对校正因子以及其他峰面积进行计算得出样品中其他成分的量，即分别采用外标法(ESM)和一测多评法(QAMS)计算其含量。

1.2.10 耐用性分析

1.2.10.1 不同色谱柱的考察 在同一高效液相色谱仪(Agilent1100),在“1.2.3”项色谱条件下考察两种色谱柱[A柱:Aglient C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、B柱:Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)]对玫瑰花中槲皮素、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷的相对校正因子的影响。

1.2.10.2 不同柱温的考察 在同一高效液相色谱仪(Agilent1100),在“1.2.3”项色谱条件下考察了柱温分别为30、35 ℃时的相对校正因子的影响。

1.2.10.3 不同流速的考察 在同一高效液相色谱仪(Agilent1100),考察了采用A柱,流速为0.8、0.9、1.0 mL·min-1时的相对校正因子。

1.3 数据处理

利用Excel软件进行数据统计,并使用Excel软件进行数据分析。相对校正因子计算公式为fs/k=(Ck×As)/(Cs×Ak),式中AS为内参物峰面积,CS为内参物浓度,Ak为待测组分的峰面积,Ck为待测组分K的浓度。

2 结果与分析

2.1 相对校正因子的计算

表1 样品中待测成分的相对校正因子Table 1 RCFs of target compounds in sample

2.2 线性关系考察

按“1.2.4”项下进行试验,结果见表2。结果表明,绿原酸、芦丁、金丝桃苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素含量在0.0931～0.3724、0.0902～0.3608、0.1800～0.7200、0.1856～1.1600、0.0059～0.0236 mg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系。

表2 线性关系考察试验结果Table 2 Calibration curve and linear range

2.3 精密度试验

槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积RSD分别为1.2%、0.8%、0.9%、1.3%、0.7%,表明,以槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷建立的高效液相色谱法精密度良好。

2.4 稳定性试验

槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷峰面积RSD分别为0.9%、1.2%、1.1%、0.8%、1.0%,表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷含量RSD分别为0.8%、0.9%、2.6%、1.2%、2.4%,表明该方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验

按“1.2.8”项下进行试验,结果见表3。由表3结果可知,各测定成分加标回收率在98.02%～99.51%之间,说明各成分回收率良好。

表3 加样回收率试验结果Table 3 Result of recovery tests

续表

2.7 样品含量的测定

按“1.2.9”项下采用外标法(ESM)和一测多评法(QAMS)计算槲皮素、芦丁、绿原酸、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金丝桃苷含量,结果见表4。由表4可知,外标法和一测多评法测定结果基本一致,RSD≤1.0%,表明一测多评法在食用玫瑰花中的适用性和可行性得到了验证。

表4 样品测定结果Table 4 Results of sample determination

2.8 耐用性分析

2.8.1 不同色谱柱的考察 采用不同品牌的C18柱A、B对绿原酸、金丝桃苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素相对校正因子的影响结果见表5。两种色谱柱下的各成分的相对校正因子的RSD均≤1.0%,表明相对校正因子重复性良好,两种色谱柱的条件下对食用玫瑰各成分对相对校正因子无显著影响,后采用常用的A柱对其他因素进行考察。

表5 不同色谱柱的考察Table 5 Investigation of different chromatographic columns

2.8.2 不同柱温的考察 柱温分别为30、35 ℃时,对相对校正因子的影响结果见表6。两种温度下的各成分的相对校正因子的RSD均≤1.0%,表明相对校正因子重复性良好,两种不同柱温条件下对食用玫瑰各成分对相对校正因子无显著影响,35 ℃下出峰较好,采用35 ℃对其他因子进行考察。

表6 不同柱温的考察Table 6 Study on the temperature of different chromatographic columns

2.8.3 不同流速的考察 在同一高效液相色仪(Agilent1100),采用A柱,流速为0.8、0.9、1.0 mL·min-1时对相对校正因子的影响结果见表7。三种流速下的各成分的相对校正因子的RSD均≤ 1.0%,表明相对校正因子重复性良好,三种流速下对食用玫瑰各成分对相对校正因子无显著影响。按照1.2.3项色谱条件下分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL,进样分析,结果见图1,样品以及混合对照品色谱峰分离度较好,其他色谱峰对含量测定无干扰。

表7 不同流速的考察Table 7 Study on the flow rate of different chromatographic columns

图1 对照品(A)、样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of control(A),sample(B)注：1.绿原酸;2.芦丁;3.金丝桃苷;4.芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷;5.槲皮素。

3 结论

本研究中芦丁作为样品中的待测组分,可近似看作内标物质,但严格讲并不是内标物质:首先,内标物质的选择首先样品中不能存在;其次,内标物为人为加入的标准品,此时加入的标准品为已知量,并且加入的量在仪器被检测的范围内,而本试验中芦丁为样品中含有物,并且量为未知。

综上所述,本文采用一测多评法测定食用玫瑰中5种成分的含量,建立并采用内标法验证一测多评法同时计算食用玫瑰中5种非挥发性成分含量的可行性,结果表明本方法操作简单、测定结果准确,可为建立食用玫瑰质量标准提供数据和方法参考。同时,将其类黄酮活性成分用于医药行业、人们日常饮用提供其附加值,这对开发潜在新药的同时深化对食用玫瑰的认识,开发食用玫瑰的社会和经济价值具有广泛意义。