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(1.天津科技大学生物工程学院,天津 300457; 2.天津科技大学化工与材料学院生物化工系,天津 300457)

丝氨酸蛋白酶抑制剂是通过与丝氨酸蛋白酶形成复合物使其部分或完全失活的一类物质的总称,它普遍存在于动物、植物和微生物中[1]。根据氨基酸排列顺序、拓扑学性质及结合机制的不同,可以将其分为16个家族,已从植物中发现了7个家族[2]。其中,大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean trypsin inhibitiors,STIs)是豆科植物中起主要作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂,包括已经发现的Kunitz类抑制剂(KTI)和Bowman-Birk类抑制剂(BBT)两种类型[3-4]。因其具有调理内源蛋白酶活性、贮藏蛋白、抗虫以及抗病原菌等生理功能,胰蛋白酶抑制剂在食品、农业和医药等领域具有潜在的应用价值[3,5]。

目前,多肽类胰蛋白酶抑制剂的制备方法主要从组织或种子中分离纯化。分离纯化过程需经过水浸、碱提取、分步盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析等程序,过程繁琐,耗时长,且产率和纯度较低[6];实验室进行小量纯化时有报道采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶进行亲和层析,但其价格昂贵[6]。随着基因工程技术的快速发展,异源表达成为获得胰蛋白酶抑制剂的一条可行途径。

大豆基因组中至少存在10个不同的sti基因[7],其中ksti3基因已经在大豆和杜氏盐藻中进行了克隆表达[2-3,7-8]。本课题组前期通过对大豆基因组中的胰蛋白酶抑制剂基因进行比对和分析,发现了一个新的编码基因sti[7],其理化特性及生理功能等尚未报道。为此,本研究借助于分子克隆技术将其在毕赤酵母中进行了异源表达,经初步纯化后,对其生化特征进行了解析,以期替代现有的胰蛋白酶制备方法,并为其实际应用提供基础材料。……