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(1.中国食品发酵工业研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京 100015; 2.广东中食营科生物科技有限公司,广东东莞 523122)

玉米低聚肽是由玉米经酶解后得到的具有生物活性的小分子,由于具有丰富的生理功能而受到广泛关注。刘文颖等[1]研究了玉米低聚肽对于DPPH、OH等自由基的清除能力,发现玉米低聚肽具有一定的抗氧化活性。Yamaguchi等[2]发现玉米肽因富含疏水氨基酸，而表现出促进乙醇在人体中新陈代谢的作用。Huang等[3]报道称，玉米肽可通过抑制一种与血压调节相关的酶—血管紧张素转换酶(ACE)的活性，从而起到降血压的作用。刘雪姣[4]通过细胞中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)等活性的变化，证明玉米低聚肽可以从促进肝卵圆细胞增殖与对抗细胞损伤两个方面保护肝干细胞。

微量元素是人体必须的营养物质,但以无机盐形式存在的微量元素在生物机体内的利用率不超过20%。而小肽由于其肽链短等分子结构性质,在体内具有吸收利用率高、排泄率低、消化稳定性好、毒性低等特点[5]。小肽还可与Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Ca2+等金属离子螯合[6-9],这些小肽螯合物兼具了小肽和微量元素的易吸收利用、抗氧化、免疫调节等多重功效[8]。硒也是人体内必须的一种微量元素,大量的研究已表明，缺硒会导致人免疫力低下、克山病等多种健康问题[11-12]。最近Yang等[13]研究发现，缺硒可能导致软骨细胞凋亡,从而引起大骨节病。Vaz等[14]研究发现,阿茨海默症的诱发也与体内硒含量水平降低相关。目前对这种肽-硒螯合的物质研究尚不完善,因此制备新型肽-硒螯合物并对其性质进行探讨，对肽类产品的应用和硒元素的人体摄入方式提供了理论基础。本文以玉米低聚肽和亚硒酸钠为原料，制备玉米低聚肽硒螯合物,以分子量分布和螯合态硒含量为指标,探究玉米低聚肽硒螯合物对温度、pH和消化方式的稳定性,以期为市场上提供一种新型补硒产品。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

玉米低聚肽 总蛋白质(以干基计)含量80%,中食海氏生物科技有限公司;五水亚硒酸钠 分析纯 天津市大茂化学试剂厂;3′3-二氨基联苯胺(DAB 4HCl)(试剂级)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)(生物技术级) Biotopped公司;氢溴酸 分析纯,天津市福晨化学试剂厂;盐酸羟胺、高氯酸、硝酸、盐酸、氢氧化钠、95%乙醇、甲苯、三氯乙酸 分析纯,北京化工厂;胃蛋白酶、胰蛋白酶 酶活20万～150万U/g,南宁庞博生物有限公司;三氟乙酸 分析纯,Alfa Aesar 公司;乙腈 色谱纯,Fisher公司;透析袋 截留分子质量8000～14000 u,Biotopped公司;去离子水 实验室自制。

EL20 pH计 Mettler Toledo;KQ-250E超声波振荡器 昆山市超声仪器有限公司;Spectra Mr酶标仪 Dynex Technologies;DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱 北京陆希科技有限公司;万用电炉 北京科伟永兴仪器有限公司;LC-20AD高效液相色谱仪 日本岛津公司;F30200150凯氏定氮仪 Velp Scientifica公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米低聚肽硒螯合物的制备 参照王小林等[15]的方法并稍做改动。取8 g玉米低聚肽溶于100 mL去离子水中,制备成8%的玉米低聚肽水溶液。加入16 g五水亚硒酸钠,于超声波振荡器中混匀。调节pH为6.0,在50 ℃条件下水浴螯合40 min。趁热迅速倒入4倍体积的95%乙醇,封口后25 ℃静置过夜。将上清液倒出,于35 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干,得到玉米低聚肽硒螯合物样品。

1.2.2 玉米低聚肽硒螯合物硒含量的测定 配制1 μg/mL的硒标准溶液,精确量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL硒标准溶液,以去离子水加至10 mL。加10 mL混酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)电加热炉上消解至澄清淡黄色状态。添加5 mL 1∶1盐酸(浓盐酸:蒸馏水),电加热炉上继续消解至1 mL。后加入10 mL 5%EDTA-2Na溶液,10 mL 10%盐酸羟胺溶液,混合后以1∶1盐酸调节pH至2～3之间。然后加入5‰ DAB溶液,遮光静置30 min。以40% NaOH调节溶液pH至6.8～7.0之间,以10 mL甲苯萃取反应产物10 min。取有机层溶液,在420 nm处检测吸光值。以硒浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,绘制硒标准曲线。

取样品重复上述步骤得到样品的吸光值。根据硒标准曲线计算得到硒含量。

1.2.3 玉米低聚肽硒螯合物得率和螯合率的计算

式(1)

其中,m1为螯合物中硒元素的质量(g),m2为加入螯合体系硒元素的质量。

式(2)

其中,m3为螯合产物质量(g),m4为加入螯合体系总物质的质量(g)。

1.2.4 玉米低聚肽硒螯合物的理化性质的测定 参照国标法GB 5009.3-2010[16],测定玉米低聚肽硒螯合物的水分含量。参照国标法GB 5009.5-2010[17]测定玉米低聚肽硒螯合物的总氮(蛋白质)含量。参照国标法GB 22729-2008[18],测定玉米低聚肽硒螯合物中酸溶蛋白的含量。采用文献[19]所述的高效凝胶过滤色谱法测定样品分子量及分布情况。

1.2.5 热稳定性实验 将玉米低聚肽硒螯合物样品溶于去离子水,配制成螯合物浓度为3 mg/mL 的溶液,取20 mL溶液置于50 mL离心管中,分别在25、40、60、80、100 ℃下恒温水浴2 h,其中25 ℃为室温对照组。冷却至室温,检测其分子量分布。然后取样3 mL置于透析袋,经蒸馏水透析60 h后检测硒含量。

1.2.6 酸碱稳定性实验 将玉米低聚肽硒螯合物样品溶于去离子水,配制成螯合物浓度为3 mg/mL 的溶液,取20 mL溶液置于离心管中,分别用1 mol/L HCl和10% NaOH 调节各管pH至2、4、6、8,10、12,于25 ℃恒温水浴锅中放置2 h,同时设置一未处理的对照组(玉米低聚肽硒螯合物的水溶液的pH介于6.5～6.8之间),冷却至室温,检测其分子量分布,然后取样3 mL置于透析袋,经蒸馏水透析60 h后检测硒含量。

1.2.7 体外模拟胃肠消化道实验

1.2.7.1 胃蛋白酶消化实验 将玉米低聚肽硒螯合物样品溶于去离子水,配制螯合物浓度为3 mg/mL的溶液,取30 mL溶液置于离心管中。以1 mol/L HCl调节溶液pH=1.5,在37 ℃恒温水浴中孵育20 min。后添加6‰(物料比)的胃蛋白酶,充分混匀,其余操作同1.2.7.1。

1.2.7.2 胰蛋白酶消化实验 将玉米低聚肽硒螯合物样品溶于去离子水,配制螯合物浓度为3 mg/mL 的溶液,取30 mL溶液置于离心管中。以10% NaOH调节溶液pH=7.5,在37 ℃恒温水浴中孵育20 min。添加2‰(物料比)的胰蛋白酶,充分混匀,迅速取出其中15 mL于沸水浴中处理20 min以终止酶解反应,作为消化前对照。剩余部分置于37 ℃恒温水浴中处理6 h,然后于沸水浴中处理20 min以终止酶解反应。室温下冷却后检测其分子量分布,然后取样3 mL置于透析袋,经蒸馏水透析60 h后检测硒含量。

1.2.7.3 先胃蛋白酶再胰蛋白酶消化实验 按照1.2.7.1的方法进行取样和胃蛋白酶消化后,用10% NaOH调节pH为7.5,在37 ℃恒温水浴锅中孵育20 min,加入2‰(物料比)胰蛋白酶,充分混匀,置于37 ℃恒温水浴中处理6 h,然后于沸水浴中处理20 min以终止酶解反应。室温下冷却后检测其分子量分布,然后取样3 mL置于透析袋,经透析袋透析60 h后检测硒含量。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,采用SPSS v20软件对实验数据进行统计学处理,数据结果采用单因素方差分析,若t检验p<0.05,则证明数据差异具有显著性。

2 结果与讨论

2.1 硒标准曲线

按照1.2.2所述方法,绘制硒标准曲线如图1所示。标准曲线为y=0.0075x+0.0143,R2=0.9987。

图1 硒标准曲线Fig.1 Selenium standard curve

2.2 玉米低聚肽硒螯合物的产物指标和理化性质

对螯合反应结果进行测算,得到玉米低聚肽硒螯合物的产物螯合率为54.25%±0.24%,得率为53.02%±0.17%,相对于类似工艺制备的肽硒螯合物[20],玉米低聚肽硒螯合物具有更高的产物螯合率和得率。对样品进行基础理化测试,得到样品水分含量为7.46%±0.07%,酸溶蛋白含量为16.38%±0.03%,总氮(粗蛋白)含量为21.17%±0.35%,酸溶蛋白占粗蛋白的比例高达77.38%。

经检测,玉米低聚肽硒螯合物分子量分布如表1所示。有超过85%的分子量分布在1000 u以下,含量最高的是小于140 u的小肽,约占50%,据报道,分子量低于1000 u组分可被肠道完整地吸收,营养价值和生理功能都比游离氨基酸更高[21-23]。

表1 玉米低聚肽硒螯合物分子量分布(%)Table 1 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide(%)

2.3 玉米低聚肽硒螯合物的热稳定性

玉米低聚肽硒螯合物在不同温度下的分子量分布情况如表2所示。结果显示,随着水浴温度的升高,分子量分布在1000 u之下的部分所占比例都有所升高,但各温度组之间的变化比例接近,都在3%～7%之间。对透析后的样品硒含量进行测定,以25 ℃为对照组,对其余各组相对对照组硒含量的比例进行比较。结果如图2所示，当温度为40 ℃时,硒含量变化不显著(p>0.05),当水浴温度处于60～100 ℃区间内时,硒含量相对比例显著降低(p<0.05),但在100 ℃时,螯合态的硒含量仍在70%以上,这说明玉米低聚肽硒螯合物对于温度有很高的稳定性。

表2 不同温度下玉米低聚肽硒螯合物分子量分布(%)Table 2 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide at different temperature(%)

图2 不同温度下玉米低聚肽硒螯合物中硒含量Fig.2 Selenium content of selenium-chelating corn oligopeptide at different temperature注:*表示不同组与对照组相比具有显著差异(p<0.05),图3～图4同。

2.4 玉米低聚肽硒螯合物的酸碱稳定性

玉米低聚肽硒螯合物在不同酸碱条件下的分子量分布情况如表3所示。结果显示,与对照组相比,在偏酸性环境下(pH=2、4),分子量超过1000 u部分所占的比例变化在13%～16%之间,而在接近中性和弱碱性环境下(pH=6、8),比例变化范围低于2%,在强碱性环境下(pH=10、12),比例变化不超过7%。说明酸性环境更利于肽链的断裂,使分子分解成更多的小肽。对透析后的样品硒含量进行测定,以未经处理的玉米低聚肽硒螯合物水溶液为对照组,对其余调节pH后的各组相对于对照组的硒含量的比例进行比较,结果如图3所示，发现硒含量在pH 2、4和12的酸性和强碱环境下显著降低(p<0.05),但最低硒含量仍在75%以上,不同的pH环境会导致蛋白质结构的变化,推测可能是酸性环境肽链断裂间接导致螯合态的硒从配体上脱落,而碱性环境对肽链的破坏能力就小得多[24-25]。酸性或碱性环境虽然使一部分肽链发生断裂,但螯合态的硒含量仍保留3/4以上的比例,玉米低聚肽硒螯合物也具有酸碱稳定性。

表3 不同pH下玉米低聚肽硒螯合物的分子量分布(%)Table 3 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide at different pH(%)

图3 不同pH下玉米低聚肽硒螯合物硒含量Fig.3 Selenium content of selenium-chelating corn oligopeptide at different pH

2.5 玉米低聚肽硒螯合物的消化稳定性

玉米低聚肽硒螯合物经过不同的消化方式处理后分子量变化情况如表4所示。结果显示,与对照组相比,经过胃蛋白酶的消化,玉米低聚肽硒螯合物分子量在1000 u以下的部分所占的比例约增加5%;经过胰蛋白酶消化后,该分子量区间所占比例约增加7%;经过两种酶消化后,该比例变化约增加8%。以未经胃蛋白酶或胰蛋白酶消化的玉米低聚肽硒螯合物水溶液为对照组,对三种消化方式处理后的各组与对照组的硒含量进行比较,结果如图4所示。经过两种酶分别和复合消化,硒含量显著降低(p<0.05)。但螯合态的硒含量最低仍能保持在70%以上,证明玉米低聚肽硒螯合物具有一定的消化稳定性。

表4 不同消化方式下玉米低聚肽硒螯合物的分子量分布(%)Table 4 Molecular weight distribution of selenium-chelating corn oligopeptide at different digestion mode

图4 不同消化方式下玉米低聚肽硒螯合物硒含量Fig.4 Selenium content of selenium-chelating corn oligopeptide at different digestion mode

3 结论

本研究以玉米低聚肽和亚硒酸钠为原料,制备出玉米低聚肽硒螯合物,并对其基础理化性质和对热、酸碱以及消化方式的稳定性做了探究。结果表明,玉米低聚肽硒螯合物的螯合率为54.25%±0.24%,得率为53.02%±0.17%,水分含量为7.46%±0.07%,酸溶蛋白含量为16.38%±0.03%,总氮(粗蛋白)含量为21.17%±0.35%,酸溶蛋白占粗蛋白的比例为77.38%,利于人体肠道吸收。

玉米低聚肽硒螯合物对于热处理具有良好的稳定性,不同温度环境下,螯合物的分子量在1000 u之下的部分所占比例变化都在3%～7%之间,螯合态的硒含量最低仍在70%以上;对不同pH环境也具有良好的稳定性,在酸性环境下,肽链更易断裂,螯合态硒含量变化最大,但最低硒含量仍在75%以上;对于不同消化方式也具有一定的稳定性,在经过胃蛋白酶、胰蛋白酶和两种酶的消化后,分子量低于1000 u的部分所占的比例分别增加5%、7%和8%,螯合态的硒虽然显著降低(p<0.05),但最低硒含量仍在70%以上。由于人体小肠对二肽、三肽的直接吸收作用,螯合态的硒可随之被机体直接利用。对于需要补充硒元素的人群,玉米低聚肽硒螯合物可作为一种新型的补硒制剂,开发成功能性产品以推广。