王小伶 付芳惠 付希安 孙乐乐 于功奇 刘 红 张福仁

弥漫性掌跖角化病是以手掌和足跖角化过度为特征的常染色体显性遗传病。本病多为婴儿期发病，延续终生。轻者仅表现为掌跖部位皮肤粗糙，重者可出现弥漫性增厚斑块、边缘清晰的角质增厚，呈黄色胼胝体样，并且可蔓延至掌跖皮肤侧缘或手足背。部分患者可伴有指节垫、指趾屈曲畸形等。根据其病理特点可分为弥漫性表皮松解性掌跖角化症(EPPK)和弥漫性非表皮松解性掌跖角化症两种亚型，前者较为常见，由Voner在1901年首次报道[1]。

1992年Reis等[2]通过对德国1个7代共18例患者的EPPK大家系进行遗传连锁分析，将EPPK的候选基因定位于17q.21.1-21.2号染色体KRT9基因。国内外多位学者对掌跖角化病进行了KRT9基因检测，相继报道27个突变点，证实KRT9基因为掌跖角化病的致病基因[1]。目前，对于弥漫性松解性掌跖角化病临床表型的研究相对较少，尚未找到基因型与临床表型明确相关性[3]。最近，有学者在一EPPK家系中发现了Leu458Pro突变，与之前首次发现该突变家系的患者临床表现有所差异，从而说明了同一个KRT9突变在不同家系之间的临床表型存在差异，并且EPPK具有高度的遗传异质性[4]。本研究报道了两个携带KRT9同一热点突变的弥漫性松解性掌跖角化病家系并分析不同家系和同一家系不同个体的临床表现。

1 材料与方法

1.1 对象 两个家系均来自中国山东，无血缘关系。

家系1共5代27人，无近亲结婚者。患者15例，男9例，女6例。无隔代遗传，遗传规律符合常染色体显性遗传(图1a)。先证者(IV3)出生不久即发病，表现为手掌和足跖部位弥漫增厚的蜡黄色斑块，延续到掌跖皮肤侧缘，边界清楚，呈暗红色边缘，散发臭味。先证者的女儿(V2),3岁,双手手指肿胀，未出现指节垫，但已出现明显的双手指屈曲障碍(图1b、1c)。先证者的祖父(II3),78岁,自出生后即发病，3岁后逐渐出现明显的指节垫和指屈曲(图1d、1e)，随年龄增长症状逐渐加重。家系中其他患者症状与先证者相似，均未出现此类症状(图1f、1g)。

家系2共4代24人，无近亲结婚者。患者12例，男5例，女7例。无隔代遗传，符合常染色体显性遗传规律(图2a)。先证者(III6)自出生开始发病，随着年龄增长皮肤逐渐粗糙、增厚，皮损泛发至整个手掌、足跖，表现为境界清楚的弥漫性角化过度性斑块，表面轻度脱屑，部分区域皮损表面呈蜡状平滑(图2b、2c)，家系中其他患者症状与先证者相似。家系内没有出现指节垫、指趾屈曲畸形现象。

1a：家系图；1b，1c：先证者女儿(V2)手指肿胀及屈曲障碍；1d,1e：先证者祖父(II3)的指节垫(箭头所指)和屈曲畸形.1f，1g：家系1中其他患者临床表现；1h：KRT9基因的测序图,箭头指向突变c.487C>T

图1 家系1

2a：家系图；2b，2c：先证者掌跖部位增厚，表面有裂纹；2d：KRT9基因的测序图,箭头指向突变c.487C>T

图2 家系2

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA制备 本研究获得山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会批准。在所有研究对象签署知情同意的前提下，抽取两个家系8例患者、4名健康者及200名健康对照的外周静脉血5 mL，置于EDTA抗凝管中。应用TGuide大体积血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)按照操作步骤提取基因组DNA。使用全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-8000(NanoDrop公司)检测DNA浓度和纯度，根据DNA原液浓度将DNA原液用灭活的去离子水ddH2O标化为30 ng/μL，纯度(A260/A280)>1.8。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 扩增KRT9基因的7个外显子，利用Primer3.0软件设计上下游引物，由北京华大基因研究中心合成。其中1号外显子的上游引物为:5’-TTGGCTACAGCTACGGCGGAGGAT-3’；下游引物为:5’-TGGTCCTTGAGATCATCAATAGTG-3’。采用12.5 μL反应体系:Taq Mix(为dNTP、Taq酶和缓冲液的混合物)6.5 μL，ddH2O 5 μL，上下游引物各0.25 μL,样本DNA 0.5 μL。反应条件:94℃预变性,10 min，进行35 个扩增循环,每个循环包括94℃变性30 s，复性59℃ 45 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min。12 g/L琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物。

1.2.3 DNA测序 采用乙醇醋酸钠纯化法获得纯化的PCR产物，使用ABI 3500XL DNA测序分析仪(美国Applied Biosystem公司)进行双脱氧链终止法(Sanger测序法)测序得到最终的测序结果。将NCBI下载的参考序列输入NCBI Nucleotide BLAST 中与测序结果进行对比分析。

2 结果

两个家系中所有参与研究的患者均在KRT9基因1号外显子上检测到c.487C>T(p.163R>W)错义突变(图1h、2d),其他外显子未发现有害突变。两个家系中的正常人及200名正常对照组中未发现此错义突变。应用基因突变致病性预测工具对此错义突变点进行功能预测，PolyPhen2值为0.999(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/bgi.shtml)；Sorting Intolerant From Tolerant(SIFT)值为0(http://sift.bii.a-star.edu.sg)。提示此突变为这两个家系的致病突变，且该位点既往在弥漫性掌跖角化病患者中多次报道。

家系1中5例患者均携带c.487C>T突变，而其临床表现有所不同。所有患者均出现掌跖角化过度，但先证者的祖父(II4)有明显的指节垫及屈曲畸形，先证者的女儿(V2)自出生不久出现手指肿胀，屈曲障碍，家系中其他患者均无此类症状。

家系2中的3例患者均检测出与家系1患者相同的基因突变，而所有患者除了掌跖部位过度角化外，均无指节垫及屈曲畸形。但先证者和其女儿(IV4)临床症状较其他患者的临床症状稍轻，患者自述本人和其女儿患病期间服用过阿维A，服药期间可轻度缓解，停药即复发，并且日常经常涂抹护手霜等乳化剂。

3 讨论

表皮松解性掌跖角化病是一种常染色体显性遗传性皮肤病，主要由编码角蛋白的KRT9基因突变所致。角蛋白是构成皮肤细胞骨架的重要成分，属于角蛋白中间丝(KIF)超家族的成员，对上皮细胞的结构完整性至关重要[5]。角蛋白分为I型和II型角蛋白，其中心部位是杆状功能区,两侧分别是氨基末端和羧基末端功能区。从氨基端到羧基端，角蛋白被分为了头、杆、尾三部分，其中杆区含有4个α螺旋结构的亚区，其间由非螺旋结构的连接区(L1，L12及L2)隔开[6]。KRT9基因全长4492 bp，其中cDNA为2353 bp，共编码622个氨基酸，第163位密码子发生突变即位于KRT9的杆区1A部位。目前，位于KRT9基因的1A螺旋区的第1外显子的和2B螺旋区上的突变已经有研究者报道过。据人类国际中间丝数据库 (human intermediate filament database)统计，引起EPPK的KRT9基因突变共有26种，21种突变位于1A区域，另外5种突变位于2B区域。本文报道的p.163R>W错义突变占所有突变的31.8%,已成为导致该病的热点突变，这可能与KRT9基因中CpG岛发生甲基化和去甲基化时出现错误有关，从而使第163位精氨酸密码子中的碱基C变为T。并且这种碱基转换的频率很高，是其他随机突变发生频率的42倍[7]。

KRT9基因导致的弥漫性松解性掌跖角化病具有高度的遗传异质性。除了导致患者掌跖部位的弥漫性增厚，部分患者会有屈曲障碍和指节垫的发生。据研究表明，指节垫和屈曲障碍是伴随患者的临床症状而存在的，它们都有一定的遗传倾向，有学者对患有指节垫症状的患者的皮损做了定量RT-PCR分析显示：基底上层出现表皮松解，这是一种由角蛋白突变引起的皮肤病的典型表现，并且表皮松解局限在由K9表达的特定层，因此他们认为指节垫是由于KRT9基因的过表达导致[8]。本研究家系1的患者中，先证者的女儿自出生不久就出现手指肿胀，屈曲障碍，先证者的祖父则有明显的指节垫及屈曲畸形，值得注意的是家系中其他患者均无此类症状。并且同样检测出p.163R>W突变的家系2中所有患者也均无指节垫和屈曲畸形。这说明KRT9的同一个突变在不同家系或同一个家系的不同个体之间的临床表型存在很大差异。

除了基因突变对临床表型的作用，后天的行为习惯及病情干预也会对临床表现有一定的作用。在一个伴有指节垫的EPPK家族中，一名右利手患者右手的角化增厚以及指节垫症状比左手症状严重，观察结果表明，角化病和指节垫可能与摩擦有关[9]。本研究家系1中的患者V2和患者II3，自幼年便出现指屈曲障碍的现象，随年龄的增长逐渐加重。再次证明EPPK患者的指节垫及指屈曲畸形现象与遗传因素相关，而后天环境可能影响其严重程度。所以，EPPK的表型谱是由遗传因素和环境因素共同作用而影响了人体内的角蛋白的表达。迄今，弥漫性掌跖角化病尚无有效的治疗措施。据报道，口服阿维A可以缓解手指屈曲障碍[10]。我们研究中的家系2患者未出现指节垫及手指屈曲障碍可能与在疾病发展过程中曾经口服过一定时间的阿维A,且日常经常涂抹护手霜等润肤剂有关。因此，早期监测手指屈曲及指节垫症状，并进行及时的治疗干预，对于预防EPPK患者的手指畸形很有必要。

总之，我们的研究发现了导致弥漫性表皮松解性掌跖角化病两家系的致病突变，并分析了KRT9基因同一个突变导致的不同的临床表型。我们推测，KRT9在EPPK、指节垫、屈曲畸形的发展过程中扮演着复杂的角色，需要进一步研究EPPK与其他遗传和环境因素之间的关系，以减轻EPPK给患者造成的心理及生活上的不便。