金德蕙 王占想 宋亚丽

恶性黑素瘤(malignant melanoma)是一种高度恶性的黑素细胞肿瘤，早期手术彻底切除后预后尚可，一旦发生转移，对放疗、化疗均不敏感，5年生存率不超过14%。因此探讨如何提高黑素瘤对放疗、化疗的敏感性，成为黑素瘤研究的热点之一。

Bcl-2-associated athanogene 1(BAG-1)基因位于染色体9p12，其编码蛋白BAG-1蛋白通过与多种靶分子结合，参与调节细胞生物学的多个环节。BAG-1蛋白主要通过其C末端与热休克蛋白(HSP)70的肽结合区结合，促进细胞增殖；还可通过激活Raf-1信号通路调节细胞增殖；在细胞表面，BAG-1与酪氨酸激酶受体如干细胞生长因子HGF/血小板衍生生长因子PDGF受体结合能增强细胞对生长因子诱导的凋亡；在细胞浆内，可与Bcl-2结合以调节细胞凋亡；在细胞核内，可与多个核激素受体如维生素D3受体、维A酸受体结合而调节相应核激素的表达与活性[1-3]。

临床研究发现BAG-1蛋白在正常组织几乎不表达或低水平表达，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高度表达。肿瘤细胞BAG-1基因表达上调可增强肿瘤细胞的抵抗转移能力，增加对凋亡刺激及化疗的耐药性；而下调其表达则增加肿瘤细胞对凋亡刺激、化疗的敏感性[1,2]。

一般认为黑素瘤对放疗不敏感，但在某些特殊情况下放疗仍是一项重要的治疗手段。目前尚未见有关BAG-1对黑素瘤放射治疗反应影响的相关文献报道。本研究通过体外实验探讨RNA干扰黑素瘤B16F10细胞BAG-1基因表达对放射线X线的敏感性的影响，并进行细胞凋亡率检测及相关机制探讨。

1 材料和方法

1.1 细胞培养及试剂 黑素瘤B16F10、M14细胞株购自南京凯基公司， RMPI 1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司; 兔抗鼠BAG-1多克隆抗体 为Santa Cruz公司产品，兔抗鼠Caspase3、8、9、PARP一抗及聚合HRP标记羊抗兔IgG二抗(货号BA1056)购自武汉博士德公司。

1.2 构建干扰质粒pGCsi-BAG-1并稳定转染黑色素瘤细胞，检测转染效率 构建干扰质粒pGCsi-BAG-1[4]。脂质体Lipo2000转染人黑素瘤细胞M14及鼠黑素瘤细胞B16F10，阴性对照组(NC-shRNA)黑素瘤细胞转染插入无关序列的干扰载体。具体操作如下：转染前一天，将人黑素瘤细胞M14及鼠黑素瘤细胞B16F10接种到6孔培养板上，接种密度(3～4)×105/mL。转染时，细胞要达到90%～95%的融合。溶液1：按照无血清RMPI 1640培养基与lipofectamine 2000按照每孔240 μL∶10 μL比例混合，温育5 min。溶液2：无血清RMPI 1640培养基与质粒按照每孔240 μL∶4 μg比例混合。将溶液1与溶液2混合，室温下置20 min。6孔培养板中的细胞用无血清RMPI 1640培养基冲洗两遍，加入2 mL无血清培养基。将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，37℃、5% CO2中保温5～6 h后更换含有血清的全培养基，培养24 h后，G418(600 μg/mL)筛选，获得BAG-1表达沉默的B16F10细胞株，G418筛选后存活细胞扩增用于后续实验，提取其RNA及蛋白，RT-PCR检测BAG-1 mRNA变化，Western blot检测BAG-1蛋白变化。

1.3 细胞放射敏感性试验

1.3.1 克隆形成实验检测细胞放射敏感性 人胚肾上皮细胞HEK293的基因表达类似于神经系统细胞，对电离辐射较敏感，是辐射机制基础研究的常用细胞株。本实验以HEK293细胞作为对照，研究M14、B16F10细胞对X射线照射的敏感性。将HEK293、M14、B16F10细胞置于含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基、5% CO2孵箱37℃孵育，2～3 d传代1次。取指数生长期细胞株，用胰酶消化后制成单细胞悬液，培养24 h后美国Varian Trilogy医用直线加速器照射。根据不同的X射线照射剂量将细胞接种于直径为100 mm培养皿中，照射X射线0、1、2、4、6、8 Gy的每皿1000个细胞，6、8 Gy的每皿2000个细胞，每组设三个平行皿。照射24 h后细胞继续培养14 d，至有克隆形成；倒去上清培养液，用PBS洗涤2次，加入75%甲醇固定液，铺满培养皿底面，固定5 min。弃去固定液，待稍干燥后加入0.5%结晶紫(甲醇配制)染色5 min，显微镜(低倍镜)下检查染色程度，当克隆着色足够时用水洗去残余染液，以每团细胞数>50个作为一个克隆计数，计算克隆形成率(克隆形成率=生成克隆数/接种细胞数×100%) 和存活分数(SF=受照射细胞的克隆形成率/对照细胞克隆形成率×100%)。描绘出的细胞存活曲线。

1.3.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤细胞对放射线的敏感性 将未转染的B16F10细胞(Control组)、阴性对照质粒转染细胞(NC-shRNA组) 和稳定转染BAG-1-shRNA的细胞(BAG-1-shRNA组)暴露于0、1、2、4、6、8Gy的 X 射线，于照射后24 h进行克隆形成实验，比较细胞放射敏感性差异。

1.3.3 细胞凋亡检测 流式细胞仪检测细胞凋亡：将Control组、NC-shRNA组和BAG-1-shRNA组细胞浓度调整为5×106/mL，培养24 h后收集细胞。参照Annexin V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒操作说明，流式细胞仪分析。在Annexin V高染而PI低染区域的细胞为早期凋亡细胞。

Western blotting检测BAG-1沉默对黑素瘤细胞凋亡相关蛋白Caspase3、8、9、PARP表达的影响：提取Control组、NC-shRNA组和BAG-1-shRNA组细胞蛋白，SDS-PAGE电泳，电泳结束后按半干转膜法转膜(NC膜)，5%的脱脂奶粉中封闭2 h, 1∶1000稀释一抗孵育，室温下于摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min,加入1∶5000稀释的二抗，室温下，摇床孵育45～60 min,TBST洗膜3次，每次10 min，用LI-COR扫膜仪扫膜，红外激光成像系统对待测蛋白进行分析。

2 结果

2.1 检测干扰BAG-1表达效率 如图1所示，与Control组相比，BAG-1-shRNA组BAG-1 mRNA和蛋白表达明显降低,分别下降了68%、71%(P<0.05)。为验证质粒的干扰效率，同时检测了黑素瘤M14细胞转染BAG-1-shRNA后BAG-1mRNA表达，显示下降程度为70%，干扰效率类似于B16F10细胞。

2.2 黑素瘤细胞放射敏感性体外试验

2.2.1 黑素瘤细胞放射敏感性检测 见图2。细胞存活曲线显示人胚肾HEK293细胞对放射线较敏感，X线 8Gy剂量照射时存活率接近0，而黑素瘤细胞M14细胞和B16F10细胞的存活率分别为1.5%和1.9%(P<0.05)。

2.2.2 BAG-1基因沉默后黑素瘤细胞对放射线的敏感性 见图3。BAG-1-shRNA组对X放射线敏感性增高，8 Gy照射存活率为0.32%，相比Control组1.9%，NC-shRNA组1.75%，存活率显著降低(P<0.05)。

2.3 黑素瘤B16F10细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

2.3.1 细胞凋亡率测定 见图4。Control黑素瘤B16F10细胞组在X线照射后凋亡率由2.5%升高至7.1%，在转染BAG-1-shRNA联合X线照射后，BAG-1-shRNA组的凋亡率达到25.3%， NC-shRNA组9.2%，差异显著(P<0.05)。

2.3.2 细胞凋亡相关蛋白检测 见图5。黑素瘤B16F10细胞BAG-1-shRNA组的pro-PARP、pro-Caspase 3等酶原蛋白较Control组和NC-shRNA组明显下降(P<0.05)，凋亡蛋白c-PARP及细胞凋亡级联蛋白c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表达均较Control组和NC-shRNA组显著增高(P<0.05)，尤其以c-PARP、c-Caspase 3的改变更为显著。结果证实Caspase酶解级联反应参与了BAG-1诱导的细胞凋亡调节过程。

图1 a：黑素瘤B16F10细胞转染BAG-1-shRNA组BAG-1mRNA表达下降了68%，M14细胞转染BAG-1-shRNA组BAG-1mRNA表达下降了70%；b、c:B16F10细胞转染BAG-1-shRNA组BAG-1蛋白表达下降了71%

图2 不同X线照射剂量，人胚肾HEK293细胞和黑素瘤M14细胞、B16F10细胞的存活曲线图3 不同X线照射剂量，黑素瘤B16F10细胞Control组、转染NC-shRNA组、转染BAG-1-shRNA组的细胞存活曲线图4 流式细胞仪检测黑素瘤B16F10细胞Control组、转染NC-shRNA组、转染BAG-1-shRNA组X线照射前、后的细胞凋亡率

图5 Western blot法检测黑素瘤B16F10细胞Control组、转染NC-shRNA组、转染BAG-1-shRNA组细胞凋亡蛋白c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9及其酶原pro-PARP、pro-Caspase 3的表达

3 讨论

BAG-1蛋白是一种多功能蛋白，具有多种调节功能：(1)抑制细胞凋亡和应激反应；(2)调节细胞信号传导；(3)影响转录活性；(4)参与调节蛋白质翻译后修饰-重组/降解，影响细胞黏附、侵袭、转移。干扰BAG-1表达可能通过抑制黑素瘤细胞增殖、促进黑素瘤细胞凋亡从而影响黑素瘤生物学行为及治疗反应[3]。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节，BAG-1的过度表达能够抑制Caspase的激活，从而能抑制诸如化学制剂、放射等诱导的凋亡[5]。因此，干扰BAG-1表达有可能通过促进黑素瘤细胞凋亡而发挥治疗辅助效应。

黑素瘤本质上抵抗放疗这一观点最初源于细胞培养研究。临床上，黑素瘤的辅助放疗主要用于淋巴结清扫和某些头颈部黑素瘤(尤其是鼻腔)的术后补充治疗，可进一步提高局部控制率[6,7]。放射增敏是指为增强射线对肿瘤细胞的杀伤效应，提高肿瘤的控制率和治愈率，应用一些药物或物理等方法来提高肿瘤细胞对射线的敏感性的过程[8]。

本研究显示X放射线8 Gy剂量照射黑素瘤细胞M14细胞株和B16F10细胞株，其存活率分别为1.5%和1.9%，提示黑素瘤细胞对X放射线相对较抗拒。在RNA干扰BAG-1基因表达后，8 Gy剂量X线照射黑素瘤B16-F10细胞存活率为0.32%，提示RNA干扰BAG-1基因表达可显著增高黑素瘤细胞对X放射线的敏感性，即具有放射增敏功能。

流式细胞仪检测显示黑素瘤B16F10细胞在X线照射后凋亡率为7.1%， 在干扰BAG-1基因表达联合X线照射后其凋亡率则高达25.3%，差异显著。进一步研究发现RNA 干扰BAG-1基因表达可显著增高黑素瘤B16F10细胞c-PARP、c-Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9等细胞凋亡相关蛋白的水平，提示促进细胞凋亡可能是干扰BAG-1基因表达所致放射增敏功能的机制之一。干扰黑素瘤细胞BAG-1表达促进细胞凋亡的具体机制有待进一步研究证实。

本研究提示干扰黑素瘤细胞RNA基因表达可能通过促进细胞凋亡发挥放射增敏功能，研究为临床黑素瘤治疗提供新的治疗靶位和治疗思路。