王缚鲲，冉向阳，陈 晶，程 琰，王廷廷，王宪灵，贺政新

随着各种侵入性医疗操作、免疫抑制剂和广谱抗生素在临床工作中的广泛应用，这些治疗手段在缓解患者病痛的同时，也使其面临侵袭性念珠菌病(IC)的威胁[1-2]；近年来，IC病发病率不断攀升[3]，严重威胁了患者的生命，带来了沉重的医疗负担。早诊断、早治疗是提高IC病治愈率的关键。IC缺乏特异的症状和体征，与一般细菌感染鉴别困难，故目前对该病的诊断依赖于实验室检测。传统的微生物培养技术依然是IC诊断的金标准，但因该方法敏感性低、检测周期长，无法满足临床需求[4]。开发快速有效的临床血清学检测诊断技术是解决这一困扰的有效途径，念珠菌烯醇化酶是其中重要的靶标分子。

烯醇化酶(Eno)在多种生物细胞中保守表达，催化2-磷酸甘油酸与磷酸烯醇式丙酮酸之间的相互转化，在糖酵解过程中起关键作用[5]。多项研究证实，Eno是一种念珠菌免疫优势蛋白，在念珠菌侵染宿主过程中可引发宿主产生高滴度的IgG型抗体，检测念珠菌Eno IgG抗体在诊断IC时具有重要价值[6-7]。Li等[8]认为检测抗Eno IgG抗体可有效区分念珠菌侵袭感染、定植和细菌感染。在前期构建表达了白色念珠菌Eno重组蛋白的基础上[9]。本研究拟建立检测抗念珠菌烯醇化酶IgG抗体免疫胶体金方法，旨在为IC实验室诊断技术提供更多探索。现报告如下。

1 材料和方法

1.1实验试剂盒仪器 牛血清白蛋白(BSA)、氯金酸、柠檬酸三钠购自美国Sigma公司；重组Eno蛋白由本实验室研制[8]；小鼠抗人IgG单克隆抗体、羊抗小鼠IgG多克隆抗体购自河北博海生物公司；硝酸纤维素膜、聚酯膜、滤纸购自美国Millipore公司；HKCB-3型恒温磁力搅拌器购自温州医疗电器厂，RD-20Ⅲ型低温高速离心机购自日本Seiko公司，BP110S型电子天平购自北京Startious公司，XYZ喷金点膜系统购自美国BIO DOT公司。

1.2研究对象和血清 根据欧洲癌症/真菌病研究与治疗组织(EORTC/MSG)建立的侵袭性真菌病诊断标准[10]，选取2011年1月—2014年12月解放军白求恩国际和平医院实验组确诊念珠菌血流感染38例为感染组和健康体检者血清50例为对照组。感染组男25例，女13例；年龄(58.6±20.2)岁。对照组男32例，女8例；年龄(60.1±18.6)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)具有可比性。感染组基础疾病：白血病3例，恶性肿瘤6例，烧伤13例，呼吸衰竭6例，腹部疾病7例，其他3例；感染组危险因素：应用广谱抗生素22例，应用免疫抑制剂11例，中性静脉置管7例，肠外营养8例，腹腔手术9例，重症监护病房治疗20例，中性粒细胞缺乏4例，急性肾功能衰竭2例。感染组血液标本共分离出38株念珠菌病原：白色念珠菌17株，热带念珠菌7株，近平滑念珠菌6株，光滑念珠菌4株，克柔念珠菌和葡萄牙念珠菌各2株。感染组在血培养出现阳性时72 h内收集(尽可能接近培养标本送检日期)血清，将其冻存于-80℃冰箱，于检测前取出使用。

1.3胶体金免疫层析试剂的制备和组装

1.3.1胶体金标记抗体的制备： 胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备。于100 ml终浓度为0.01%的沸腾氯金酸中加入1.5 ml的1%柠檬酸三钠溶液，反应稳定后溶液至亮红色，经滤膜过滤，重新定容至原体积。以透射电镜和紫外-可见光光谱观察确定，金颗粒的直径约为30 nm。按2 μl/ml 比例加入0.2 mol/L 的碳酸钾溶液至金溶液中，混匀后按8 μg/ml的比例加入1.0 mg/ml的小鼠抗人IgG逐滴加入，边加边搅拌，混匀后静置，4 ℃过夜；加入BSA至终浓度为10 g/L，继续搅拌20 min，4 ℃静置4 h取出，4 ℃ 10 000/min离心20 min。弃上清液，加入10%原溶液体积的复溶液(0.01 mol/L TRIS，5%蔗糖，1%海藻糖, pH 8.5)。

1.3.2金标垫的制作：将BIO DOT点膜系统设置包被量为10 μl/cm，将上述制备的金标液喷涂于奥斯龙9864玻璃纤维上，宽度为5 mm，长度为30 cm。喷金后放入烘箱37℃烘干。

1.3.3硝酸纤维素膜的包被：重组Eno蛋白和羊抗小鼠IgG多克隆抗体用0.01 mol/L的pH 7.53磷酸盐缓冲液稀释。为确定捕获用的重组Eno蛋白最佳包被量，Eno在预实验中分别稀释至0.5，1.0，1.5和2.0 mg/ml。羊抗小鼠IgG稀释至1.0 mg/ml。继而，用BIO DOT点膜系统将其分别包被在硝酸纤维素膜上，包被量为1 μl/cm，置37℃烘箱烘干。

1.3.4检测试纸条的组装：将包被的硝酸纤维素膜，金标垫，样本垫，吸水垫等依次贴合于PVC背板上，此按5 mm/条的宽度将其切割分装于塑料外壳中，干燥密封后室温保存备用。(见图1。)

图1免疫胶体金层析试纸组装示意图

1.3.5试纸检测原理及方法：检测时，将待检血清滴加于样本垫上，15 min左右读取结果。含抗念珠菌Eno IgG的阳性血清样本滴加于样本垫上，向吸水垫方向流动。抗Eno与金标垫上的小鼠抗人IgG结合后被硝酸纤维素膜上包被的重组Eno蛋白捕获，形成重组Eno-抗Eno IgG-小鼠抗人IgG复合物沉淀于检测线处，呈肉眼可见的红色。未结合的小鼠抗人IgG继续向前流动，被质控线处的羊抗小鼠IgG捕获形成小鼠抗人IgG-羊抗小鼠IgG复合物，沉淀于质控线处，呈肉眼可见的红色。不含抗念珠菌Eno IgG的阴性血清在检测线处无沉淀形成，仅质控线呈红色。读取结果时，阳性标本在检测线和质控线处可见两条红线，而阴性标本仅形成质控线一条红线。见图2。

图2 免疫胶体金检测试纸原理示意图

1.4临床样本检测 将2组收集的血清50 μl滴加于样本垫上，15 min后读取结果。以血培养结果作为金标准，计算免疫胶体金法检测的灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。PPV=真阳性/(真阳性+假阳性)，NPV=真阴性/(真阴性+假阴性)。

2 结果

2.1确认最佳重组Eno包被量 用4个浓度的重组Eno包被试纸分别检测阳性和阴性血清，计算约登指数，综合考虑灵敏度和特异性之间的平衡，确认约登指数最高的包被浓度1.0 mg/ml作为最佳包被浓度。见表2。

表2 不同浓度重组Eno包被的胶体金试纸检测效能

*约登指数J(t)=灵敏度+特异性-1

2.2试纸检测临床样本结果 感染组38例IC血清共检出27例阳性：白色念珠菌11例(11/17)，热带念珠菌5例(5/7)，近平滑念珠菌5例(5/6)，光滑念珠菌3例(3/4)，葡萄牙念珠菌2例(2/2)和克柔念珠菌1例(1/2)。对照组50例无感染者血清，弱阳性2例。由此计算该试纸用于检测念珠菌血流感染的灵敏度为71.1%、特异性为96.0%、PPV为93.1%和NPV为83.4%。

3 讨论

IC的早期快速诊断技术是研究的热点与难点之一，免疫胶体金层析技术不需要特殊的仪器与场地，操作简便，在感染性疾病诊断中被广泛应用[11-13]。本研究制备了一种可以检测患者血清中抗念珠菌Eno IgG型抗体的免疫胶体金层析试纸，已应用于IC的诊断。该试纸以重组的Eno蛋白包被于硝酸纤维素膜上，与金标垫上包被的金标小鼠抗人IgG单克隆抗体配对，检测人血清中的抗Eno IgG抗体。硝酸纤维素膜上重组Eno的包被量对试纸的检测效能有最直接的影响，过高可能导致假阳性，过低则可能导致假阴性。本研究确认最佳包被浓度为1.0 mg/ml(喷膜1 μl/cm)。

白色念珠菌Eno蛋白存在于念珠菌细胞壁[14]，检测该蛋白的相应抗体可用来诊断IC病[7-8]。本实验组在前期研究中制备了重组Eno蛋白[9]，并利用小鼠模型证实了Eno是一种免疫优势蛋白[15]，应用价值好。本研究中制备的免疫胶体金层析试纸检测念珠菌血流感染的灵敏度、特异性、PPV和NPV分别为71.1%、96.0%、93.1%和83.4%。与ELISA实验相比，对于IC，胶体金法有更高的PPV值和特异性，能在早期筛查性实验中更可靠地发现CI患者。Clancy等[16]用白色念珠菌Eno可检测不同IC患者血清中的抗Eno抗体，与本研究结论一致。用重组白色念珠菌Eno制备的胶体金试纸可成功的检测多种念珠菌(白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、葡萄牙念珠菌和克柔念珠菌)感染者血清中的抗Eno抗体。

当前有多种实验室诊断技术如ELISA[17]，PCR[18]，β-葡聚糖检测[19]等被研究应用于IC的实验室诊断，特别是葡聚糖检测法已经商品化并在临床得到了推广。这些技术普遍需要较长的检测时间和较为复杂的技术手段。本研究制备的胶体金检测试纸可以在15 min内对念珠菌抗Eno IgG型抗体作出检测，用于诊断IC，方法简便易行，适合在基层医疗单位和野外特殊条件下使用。