李 睿，辛力华，张 青，张琼芳，王 芳，任 然，熊大迁

耐药菌株的出现给抗感染治疗带来极大困扰，细菌一旦对抗生素产生耐药性且未经及时治疗和控制，可导致患者间及患者与医务人员之间出现交叉感染，甚至暴发流行[1-3]。肺炎克雷伯菌在自然界土壤、水源中分布广泛，同时亦是人类肠道菌群的重要组成部分。当人体免疫力降低时，肺炎克雷伯菌可作为条件致病菌引起肺炎、肠炎、泌尿系统炎症、败血症等多种类型的感染。碳青霉烯类抗生素因具有抗菌谱广、抗菌活性强、β-内酰胺酶稳定性高、副作用小等优势，被广泛用于多重耐药肠杆菌科细菌引起的严重感染，导致了碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌诞生，尤以碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(KPC)最常见[4-5]。由于可供选择的抗生素范围有限，其预防和感染控制难度较大，患者预后差、病死率高，现已引起了WHO的广泛关注[6]。本研究收集了我院临床分离的31株KPC进行药敏试验及耐药表型、基因型检测、同源性分析，旨在了解KPC耐药情况及耐药基因特点，为临床抗感染治疗及院感防控提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集我院2016年7月—2017年4月临床标本中分离出的31株KPC纳入试验范围，质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯ATCC700603、肺炎克雷伯ATCCBAA-1705，肺炎克雷伯ATCCBAA-1706。

1.2实验仪器与试剂

1.2.1实验仪器：生物梅里埃VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定/药敏分析仪、BACT/ALERT 3D 60/120血培养仪、二氧化碳培养箱，生物安全柜，比浊仪、伯乐PCR仪、伯乐电泳仪、北京六一照交仪。

1.2.2实验试剂：①AST-GN13药敏卡，包括环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、四环素、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、美罗培南、亚胺培南、哌拉西林、复方新诺明16种抗生素。美国Thermo Fisher的细菌基因组提取试剂盒和PCR MIX。②血平板、麦康凯平板、嗜血巧克力平板、普通巧克力平板、血培养瓶均为生物梅里埃公司产品。药敏纸片英国公司Oxoid公司生产。

1.3细菌鉴定与药物敏感性试验 分离鉴定及药敏试验按照《全国临床检验操作规程》[7]进行操作，所有菌株经法国梅里埃公司全自动微生物鉴定药敏分析系统(VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定/药敏分析仪)进行鉴定。药敏结果判定符合美国临床实验室标准委员会(CLSI-M100-S26)标准[8]。

1.4产碳青霉烯酶表型 按CLSI标准进行Hodge试验，将配置所得麦氏度0.5的标准大肠埃希菌ATCC25922经无菌生理盐水以1∶10比例稀释后均匀涂于M-H琼脂平板上，干燥3 min以后，将10 μg/片的厄他培南或美罗培南药敏纸片贴于平板中央，待测菌株从药敏纸片边缘向平板边缘画线，长度20～25 mm，操作过程严格遵循无菌操作原则，置于35℃温箱孵育过夜。产碳青霉烯酶阳性判定标准：被测菌株画线与大肠埃希菌抑菌ATCC25922圈交叉处见到大肠埃希菌向药敏纸片方向生长增强。

1.5细菌DNA模板制备 选择3～6个新鲜菌落，滴加400 μl双蒸水后振荡均匀，沸水浴15 min，冰浴2 min后，离心10 min(转速15 000 r/min)，取上清液为细菌DNA模板，置于4～8℃冰箱保存。

1.6细菌耐药基因PCR检测 引物设计参照文献[9]。引物由生物工程公司(上海)合成。见表1。PCR反应体系共50 μl，包括 25 μl的Taq PCR Master Mix，2 μl的上、下游引物，1 μl的待测菌DNA模板，20 μl的双蒸水。反应参数：94℃预变性5 min，变性94℃ 1 min →退火1 min→72℃ 90s，循环35个周期 →72℃延伸10min。取10μl PCR反应产物经含4S Red plus的20 g/L琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统观察分析并拍照保存。

表1 引物序列及目的产物长度

1.7PCR产物测序分析 PCR产物提纯后送生物工程公司(上海)测序，测序结果在NCBI网站用BLAST比对，确定基因型。

1.8ERIC-PCR同源性分析 PCR反应体系共25 μl，包括 0.4 μl 的5 U/μl Exp Tap，2.5 μl 的10×buffer，2 μl 的2.5 mmol/L dNTP，2μl上、下游引物，2μl待测菌DNA模板， 双蒸水补足至25 μl。反应参数：94℃预变性3 min，变性94℃ 1 min →55℃ 1 min→72℃ 90 s，循环35个周期 →72℃延伸10 min。引物序列：R-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC，F-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳45 min(90V)，紫外凝胶成像仪拍照。统一基因型：扩增条带完全相同；亚型：主条带相同，副带相差1或2条；不同基因型：条带相差2条以上。

2 结果

2.1菌株分布 31株KPC主要来源于重症监护室，共19株，占61.29%；急诊科6株，占19.35%；呼吸内科3株，占9.68%；肾内科、心内科、康复科各1株，占3.23%。

2.2药敏试验结果 所测KPC菌株对β-内酰胺类药物100%耐药，仅部分菌株对四环素、庆大霉素、阿米卡星、复方磺胺甲口恶唑表现敏感，敏感率分别为3.23%、9.68%、90.32%、67.74%。见表2。

表2 31株KPC药敏试验结果

2.3改良Hodge试验结果 改良Hodge试验结果发现31株KPC中29株均为阳性。

2.4PCR扩增结果及序列分析 30株肺炎克雷伯菌以KPC引物扩增出目的条带，经测序及NCBI网站BLAST比对证实为blaKPC-2基因型；1株肺炎克雷伯菌以IMP11引物扩增出目的条带，经测序及NCBI网站BLAST比对证实为blaIMP-1基因型。电泳结果见图1。

2.5ERIC-PCR结果 ERIC-PCR扩增条带2～4条，31株KPC可分为30株A1型(包含KPC-2基因)及1株A2型(包含IMP-1基因)。电泳结果见图2。

图1部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌PCR扩增产物电泳图

M为Marker DNA2000，1～6为产blaIMP-1的肺炎克雷伯菌

图2部分碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌ERIC-PCR扩增产物电泳图

M为Marker DNA2000，1～17为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌菌株

3 讨论

碳青霉烯类抗生素系治疗多重耐药菌感染的临床常用β-内酰胺类抗生素，上世界90年代末碳青霉烯类抗生素进入国内市场，使用量迅速增长，但同时也导致了KPC的产生，给临床疾病的治疗带来更大威胁。目前认为KPC产生机制与膜孔蛋白表达质/量的缺失合并及产碳青霉烯酶相关[10-11]。现已发现KPC1～17等16种亚型(KPC-1与KPC-2被证实为相同类型)，其中以KPC-2及KPC-3最为常见[12-13]。本研究中31株肺炎克雷伯菌共有30株(96.77%)经测序证实为KPC-2，提示我院目前主要流行KPC-2，与国内外报道[14-16]的流行趋势一致。本研究还发现KPC菌株主要集中于重症监护室，提示该科室患者为KPC菌株感染高危人群，可能存在耐药菌株，在一定条件下易导致院内传播，应引起临床重视，重点防控。

改良Hodge试验结果是CLSI推荐的KPC基因型碳青霉烯酶筛查方法，本研究检测结果与PCR检测结果具有较高一致性，敏感性高达93.55%，2株KPC-2基因型Hodge试验呈现出假阴性，其原因可能与被测菌株耐药基因丢失或低水平表达相关。黄峰等[17]采用改良Hodge试验与KPC基因检测结果的符合率高达100%，提示改良Hodge试验具有较高灵敏度，可用于疑似产碳青霉烯酶细菌的表型监测。李轲等[18]发现碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对大多数抗生素耐药，仅氨基糖苷类、氟喹诺酮类、黏菌素等抗生素可在体外发挥抗菌效果。本研究药敏试验结果显示，KPC菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、美罗培南、亚胺培南、哌拉西林等β-内酰胺类药物均100%耐药，仅部分菌株对四环素、庆大霉素、阿米卡星、复方新诺明存在活性，这给临床治疗带来极大困难，进一步探究发现这些细菌均源于ICU标本，疑有高度同源性。

ERIC-PCR方法操作简单便捷，可作为实验室大量菌株初步分型检测的常用方法，同时本研究结果还可显示我院存在克隆菌株流行趋势。因此，临床医师应谨慎合理的选择抗菌药物的使用，加强KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的监测，防止耐药性传播。临床科室做好医院环境的消毒隔离，强化医护人员无菌操作培训教育，提高多重耐药菌医院感染控制的重视，减少医院内交叉感染，有效防止耐药菌株进一步蔓延扩散。

综上所述，产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药程度较高，临床治疗较为棘手，感染患者预后差，应采取积极防控措施遏制其流行趋势。