陈良凤，王 建， 王雪梅

子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤，全世界范围内每年约有74 000人死于该病[1-2]。Bokhman[3]将子宫内膜癌分为I型和II型：I型是雌激素相关的子宫内膜癌，与肥胖症及子宫内膜增生相关，预后较好；II型是雌激素非依赖性的非子宫内膜癌(主要为浆液性和透明细胞癌)，与萎缩性子宫内膜相关，预后较差。尽管多数子宫内膜癌分级低、分期早，预后可；但高级别和晚期的子宫内膜癌病死率高且预后差[4]。目前子宫内膜癌主要采取手术联合放化疗治疗，患者的耐受性及预后不理想[5]，故非传统药物治疗正成为治疗无反应或不愿意接受标准药物治疗的子宫内膜癌患者候选方式。

桑黄素是从姜黄植物根中提取的一类具有广泛抗癌作用潜力的药剂，因其有抗炎和化疗的特性且毒性小，广泛应用于多种疾病的治疗[6-7]。研究证实，桑黄素能选择性作用于癌细胞而不损伤正常细胞[8]，其抑制肿瘤的潜在机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、血管生成及癌细胞的侵袭、转移、凋亡有关[9]。桑黄素及其类似物对多种肿瘤模型包括胶质母细胞瘤[10]、结肠直肠癌[11]、肺癌[12]、卵巢癌[13]、乳腺癌[14]和口腔癌[15]等均有抑制作用，但对子宫内膜癌的作用少有报道。本研究拟探讨桑黄素对子宫内膜癌细胞恶性行为的影响及相关作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验细胞系和试剂：子宫内膜癌细胞AN3-CA由上海细胞生物研究所提供。细胞在含有10%胎牛血清(FBS)，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的培养基中培养，在37℃、 5%CO2培养箱中培养，生长至80%左右浓度时进行传代、冻存和后续的实验。RPMI-1640培养液、10% 新生小牛血清、含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素、0.25% 胰酶溶液购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO) 购自Sigma公司。MMP-2、MMP-9及GAPDH一抗购自abcam公司，二抗购自武汉三鹰公司。

1.1.2实验药物和试剂：桑黄素购自Sigma公司。将桑黄素溶解于DMSO，浓度分别设定为0、10、20、40 μmol/L。Annexin V-FITC /PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自上海美季生物技术有限公司。CCK-8试剂盒购自百赛克生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞活性的测定：使用CCK-8试剂盒测定细胞的活性。将AN3-CA细胞接种在96孔板中，每孔1×104个细胞和100 μl培养基。在37℃、5%CO2的培养箱中孵育24 h。更换新培养基。细胞用分别以0、10、20、40 μmol/L浓度的桑黄素处理24 h和48 h。处理后，将96孔板中的培养基用新鲜培养基替换。然后加入20 μl的CCK-8溶液，并在37℃下孵育4 h。使用酶标仪板在450 nm波长下测量不同组的OD值。实验重复3次。

1.2.2流式细胞术检测细胞的凋亡：流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色被认为是理想的定量测定细胞凋亡的方法。将AN3-CA细胞以2×106的密度接种在6孔板中细胞/孔并生长24 h。然后用不同浓度(0、10、20、40 μmol/L)的桑黄素处理24 h。加入100 μl细胞悬液5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，并将细胞在黑暗中孵育30 min。 PI(5 μl，浓度为10 μg/ml)加入细胞，在黑暗中再次孵育10 min。实验重复3次。

1.2.3Transwell侵袭实验：通过Transwell对AN3-CA细胞侵袭能力测定。将AN3-CA细胞在含有0.1%FBS的DMEM中培养24 h后，将在无血清的DMEM中的2×105个饥饿细胞用含有基质胶的小室(直径6.5 μmol/L，孔径为8 μm，Corning，NY，USA)接种在上室中，将具有10%FBS的培养基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面上的细胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%结晶紫溶液染色10 min，自来水冲洗干净过后，于倒置显微镜下计数。实验重复3次。

1.2.4蛋白免疫印迹检测：根据蛋白相对分子质量大小，配制凝胶，根据所测蛋白浓度适量加入蛋白样品及每孔5 μl的蛋白marker。跑胶，首先加压80 V，保证所有样品在同一水平线，待样品至分离胶处，将电压加到120 V。切胶，根据所需条带大小，对照蛋白Marker进行切胶，并准备与所切胶条相同大小滤纸2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)。按照滤纸、胶、PVDF膜、滤纸的顺序按序排好，并赶出气泡，压紧，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min进行转膜。转膜结束后，PBST洗膜1次，并放入脱脂奶粉中封闭1 h;一抗，PBST洗膜1次，将膜浸入稀释好的一抗中，4 ℃过夜；二抗，PBST洗膜3次，将膜浸入稀释好的二抗中，常温下孵育1 h；显影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光并分析。

2 结果

2.1不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞活性的比较 与对照组比较，当桑黄素作用24 h时，细胞活性分别为100.0%、(71.3±4.2)%、(62.9±3.7)%、(57.5±7.8)%，差异有统计学意义(F=46.62，P<0.05)；当桑黄素作48 h时，细胞活性分别为100.0%、(31.0±6.3)%、(26.1±2.7)%、(18.6±4.4)%，差异有统计学意义(F=257.5，P<0.05)。AN3-CA的细胞活性以时间和剂量依赖性方式减少。见图1。

2.2不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞凋亡的比较 当桑黄素作用浓度分别为0、10、20、40 μmol/L时，细胞的凋亡率分别为[(3.9±0.3)%、(9.6±1.0)%、(16.2±0.8)%、(25.8±3.2)%，差异有统计学意义(F=88.68,P<0.05)。AN3-CA细胞的凋亡率以剂量依赖性方式增加，药物浓度越高，细胞的凋亡率越高。见图2。

2.3不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞侵袭的比较 以0、10、20、40 μmol/L浓度的桑黄素处理AN3-CA细胞48 h后，穿过的细胞数量分别为(78.2±7.3)、(59.3±6.5)、(58.7±10.8)、(35.0±5.2)个，差异有统计学意义(F=15.7,P<0.05)，尽管在10、20 μmol/L桑黄素浓度作用细胞时的侵袭细胞数量比较差异无统计学意义，但40 μmol/L时，侵袭细胞数量少于其他浓度组。AN3-CA细胞的侵袭能力以剂量依赖性方式减少，药物浓度越高，细胞侵袭能力越弱。见图3。

2.4不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞表达基质金属蛋白酶(MMP)MMP-2和MMP-9的比较 不同浓度桑黄素作用后MMP-2的相对表达量分别为1.00、0.73±0.05、0.53±0.12、0.25±0.06，差异有统计学意义(F=49.21，P<0.05)和MMP-9的相对表达量分别为1.00、0.81±0.06、0.48±0.08、0.32±0.12，差异有统计学意义(F=35.09,P<0.05)。在使用桑黄素时MMP-2和MMP-9的表达显著降低，且呈剂量依赖性方式减少。见图4。

图1不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞活性的影响

图2不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞凋亡的影响

图3 不同浓度桑黄素对子宫内膜癌AN3-CA细胞侵袭的影响

图4不同浓度桑黄素影响子宫内膜癌AN3-CA细胞表达MMP-2和MMP-9蛋白的影响

3 讨论

近年来，子宫内膜癌发病率增高[16]，且其对化疗药物的耐药性升高，故降低该类患者的病死率及寻找新的治疗方式十分重要。目前越来越多的学者将研究重点放在天然产物中提取出的抗肿瘤活性化合物上。桑黄素已被报道显示等如抗氧化剂、抗炎和抗癌能力多种生物学作用[7]。据报道黄酮类化合物与传统放化疗治疗相比，对癌症的控制效果更明显[17]。Chun等[18]发现桑黄素与端粒酶抑制剂MST-312联用可改善癌症预后。Gupta等[19]认为桑黄素通过抑制信号转导和转录激活因子3，可有效抑制肿瘤细胞生长。文献报道，桑黄素可通过直接下调肺癌细胞系中miR-135b的表达发挥抗肿瘤功能[20]。本研究通过CCK-8检测不同浓度桑黄素作用于子宫内膜癌细胞系AN3-CA，结果显示,随着桑黄素浓度增加，AN3-CA细胞活性明显受抑制且随时间延长抑制作用加强；为进一步探寻桑黄素对AN3-CA细胞凋亡及侵袭的影响，本研究分别使用流式染色及Transwell实验对桑黄素作用后的AN3-CA进行评估，发现桑黄素作用后AN3-CA细胞凋亡明显增加，迁移能力明显减弱；均提示桑黄素对子宫内膜癌存在抑制作用。

MMP-2和MMP-9在癌症侵袭和转移的关键基膜Ⅳ型胶原降解中发挥重要作用[21]。MMP-9的过度表达可导致肿瘤细胞增殖、迁移，桑黄素能作用于MMP-2和MMP-9，使其表达显著降低[22]，可能是其抑制肿瘤细胞转移和及侵袭的关键，而桑黄素是否能通过抑制MMP-2和MMP-9表达有效抑制子宫内膜癌的转移及侵袭尚未可知。本研究结果显示，在使用桑黄素后，MMP-2和MMP-9的表达显著降低，且随着浓度剂量的升高抑制效应越显著。说明桑黄素可能通过下调MMP-9或MMP-2表达来抑制AN3-CA细胞迁移和侵袭。

综上所述，桑黄素可明显抑制子宫内膜癌AN3-CA细胞活性、迁移，并可促进其凋亡，机制可能是通过调节MMP-2及MMP-9的表达来实现。本研究将继续进行桑黄素作用于临床子宫内膜癌样本、动物模型及潜在机制的研究，为子宫内膜癌新治疗方式提供有效证据。